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IAPP源胰岛淀粉样蛋白的形成和对体外猫胰岛细胞毒性作用及相关机制的研究

沈洁  
【摘要】: 目的:本实验从猫胰岛细胞培养着手,通过高糖诱导IAPP形成 胰岛淀粉样变性蛋白(islet amyloid,IA)沉积,探讨影响IA形成的因 素;分别研究胰岛淀粉样纤维前体(亦称为无定形物质,amorphons,Am)、 胰岛淀粉样纤维(islet amyloid fibril,IAf)、糖基化-IAPP(AGEs-IAPP) 三种形式的IA对细胞的毒性作用及可能机制,旨在为2型糖尿病发生、 发展机制和治疗途径的研究提供部分实验依据。 方法:1、探索猫胰岛细胞单层、组织块二种培养方法;用thT荧光 染料、刚果红和透射电镜三种方法,对持续高糖环境培养胰岛细胞IA的 形成进行动态定量、定性检测;用放射免疫法检测培养液IAPP、胰岛素 (Ins)的动态变化; 2、对高糖诱导形成IA的胰岛细胞作分泌功能检测,用鬼比环肽- 罗丹明进行F-actin荧光染色及ACAS检测[Ca~(2+)]i改变;将不同浓度梯度 的IAf孵育培养的胰岛细胞,用荧光偏振法测细胞膜流动性、ACAS分别记 录各组[Ca~(2+)]i动态变化,并设立预处理组包括Ca~(2+)通道阻断剂组、无Ca~(2+) 培养液组和胆固醇治疗组,进一步研究IAf对[Ca~(2+)]i改变的机制;将制 备并鉴定的AGEs-IAPP等级梯度稀释后孵育胰岛细胞24h,应用MTT法测 细胞活力。 结果:1、二种方法培养的细胞生物学活性良好;高糖环境持续 培养第10天thT染色出现典型IA荧光小滴;第14d和20d的组织组经刚 果红染色和电镜检测显示第14d细胞内Am形成,第20d细胞外出现Am;ACAS 检测thT荧光强度显示低糖组与高糖组有显著性差异(P<0.001),而在 高糖组间差异不明显(P>0.05);Am形成后荧光强度呈时间依赖性增强; 荧光强度与IAPP/Ins摩尔比率的线性分析提示呈正相关(r=0.933,P< 0.001)。线性回归方程Y=sl+1829xO代表荧光强度,互代表比率); 2、Am的胰岛细胞高糖刺激后分泌功能受损,与正常猫对照组、 同等条件培养的鼠对照组均有显著性差异;F-ac t i n结构紊乱、伪足消失; [Ca’”]i较正常组荧光强度低(Prto.001),高糖刺激后[Ca’”*改变无显著 性差异叩>0.05); 3、膜流动性和【Ca‘刁i在IAf各浓度组中呈剂量依赖性升高,与 对照组相比有显著性差异(P<0.001),而在可溶性IAPP各组中与对照组 差异不明显(P>0.05)。Ca‘”通道阻断剂预处理后加 10PMIAPP,[Ca’“h 仍高于对照组(P<0.om),而无钙培养液和胆固醇预处理后加10 v 皿MP,【玫”h与对照组无显著性差异(P>0.05); 4、将不同梯度稀释的AGES-IAPP孵化24h的胰岛细胞进行MTT 检测的结果显示,OD值呈剂量依赖性下降,与对照组比较有显著性差异叩 均<0.05); 结论:二种方法培养的猫胰岛细胞生物学功能正常,是体外实验尤 其是IA体外研究的良好材料;高糖可诱导IAPP的表达,第10d出现A认 形态学结果提示IA形成最早的部位可能在分泌颗粒内。Am形成的量呈时 间依赖性增加,与IAPP/Ins摩尔比率呈正相关,与高糖浓度相关性不明 显;细胞内Am形成可能通过破坏细胞骨架吓飞c t i n)而致I巳受体缺陷, 钙池释放 Ca‘“减少,[Ca’”h下降,最终影响胰岛细胞分泌功能;IAf细胞 毒性可能通过影响细胞膜流动性,形成非选择性阳离子通道,导致外钙的 不可调控性大量内流,终致钙超载而损伤细胞,胆固醇具有桔抗此毒性作 用;AGES{APP具有细胞直接毒性作用影响细胞活力。


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