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《第一军医大学》 2001年
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腺相关病毒载体介导变异体DHFR和GFP融合基因入人外周血干/祖细胞的实验研究

李黎波  
【摘要】: 目的:在以造血干细胞为靶细胞的基因治疗中,如何将外源基因导 入静止状态的造血干细胞中是目前面临的最大障碍之一。人类造血干细 胞中的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达水平不足以对抗氨甲喋呤 (MTX)引起的造血功能抑制~[1]。以腺相关病毒(AAV)为载体,将22和 31位置双突变的DHFR(mDHFR)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因导入外周 血造血干细胞,达到保护机体造血功能的目的,同时建立一个简便、易 行的检测目的基因的体系。 方法:构建携带人mDHFR和GFP融合基因的重组腺相关病毒载体 (rAAV/mDHFR-GFP),经293细胞包装成重组病毒;将重组病毒分别感染 NIH3T3细胞和人外周血来源的CD34~+细胞,经PCR检测,NIH3T3细胞中 含有人mDHFR和GFP cDNA;RT-PCR证实转染后的CD34~+细胞中含有mDHFR 和GFPmRNA。用MTX加压培养,MTT法显示了人mDHFR在两种细胞中均有 表达,转基因组与未转基因组耐药性有一定差异,经流式细胞仪和荧光 显微镜观察基因转染率。 结果:1.成功用甘氨酸LINKER连接mDHFR和GFP产生相应的融合 基因,构建了rAAV/mDHFR-GFP重组载体,并成功表达。2.PCR证实腺 相关病毒载体可将mDHFR-GFPcDNA导入外周血造血干祖细胞。3.RT-PCR 证实病毒转染后的CD34~+细胞中有mDHFR和GFPmRNA的存在,表明导入 的目的基因在靶细胞内的确切存在。4.rAAV/mDHFR-GFP重组病毒分别 感染NIH3T3细胞和外周血CD34~+细胞,感染率可高达25%,外周血CD34~+ 细胞中可见绿色荧光蛋白表达。5.MTT法证实转基因细胞耐药性较未转 基因细胞有一定提高。 结论:甘氨酸LINKER将两个不同的基因片段连接成功,腺相关病 毒载体可将mDHFR-GFP融合基因成功导入外周血干祖细胞,转入的目的 基因在靶细胞中可有效表达,产生相应有功能的物质(包括蛋白质),使 经转染的外周血干祖细胞对MTX的耐药性增强,今后仍需进一步改善AAV 结构、包装系统和基因转染技术,以提高基因转导效率。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R457.7

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