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《第一军医大学》 2002年
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端粒酶表达的转录调控和信号传导机制

庞建新  
【摘要】: 目的:人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶活性调节的限速亚单位,是正常细胞和肿瘤细胞端粒酶活性明显不同的原因。hTERT是通过转录调控的,涉及到转录因子c-Myc,Sp1的转录激活作用;PHA可以诱导Jurkat T细胞端粒酶激活。本文目的在于:探讨转录因子c-Myc,Sp1对端粒酶的转录作用及PHA激活端粒酶的信号传导途径,为更好地理解肿瘤发生的机理及寻找端粒酶特异抑制剂提供理论依据。 方法:用脂质体将Sp1、c-Myc反义寡核甘酸(Oligodeoxynucleotide,ODN)或Sp1、Sp3表达载体转入培养至对数生长期的Jurkat T细胞(2-3×10~6细胞/ml),预孵育30min后(表达载体预孵育时间为1h),5%CO2、37℃恒温箱中继续培养36h。用端粒酶PCR—ELISA方法检测端粒酶活性,PCR产物用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离,并通过银染显示DNA梯度。用逆转录PCR方法检测Sp1、c-Myc和hTERT mRNA水平,用Westernblot检测蛋白水平,用MTT法检测细胞增殖作用;采用脂质体将显性负突变ras、raf表达载体及反义H-ras ODN、反义c-raf ODN转入Jurkat T细胞,或应用信号传导特异抑制剂抑制Jurkat T细胞后,用PHA诱导细胞端粒酶表达,用逆转录PCR方法检测转染效果,并用端粒酶PCR—ELISA方法检测端粒酶活性,PCR产物用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离,并通过银染显示DNA梯度。 结果:(1)转染反义Sp1 ODN(1μmol·L~(-1))明显抑制Sp1 mRNA和蛋白表达,抑制率分别为44.8%(P<0.05)和57%(P<0.01);转染反义c-MycODN(1μmol·L~(-1))对c-Myc mRNA表达抑制率为36.2%(P<0.01);转染1μmol·L~(-1)反义Sp1 ODN、反义c-Myc ODN后,端粒酶活性抑制率 第一军医大学博士学位论文 分另为43.1%(P<0刀1)和27.2%(P<0刀*;在0二5、o.5、1刀、2刀(n mol *”‘) 时,反义 SP ODN表现为明显的剂量依赖性端粒酶抑制作用,而反义 O*c0*在该剂量范围内,剂量依赖性抑制作用不明显:(2转染1 n mol·L”‘反义* ODN、反义 c-Myc ODN后,hTERTmRNA抑制率分 别为 43*%(P<0*1)和 23.4%(P<0*5);(3)Spl、Sp3载体转化 36小时, Spl、Sp3蛋白水平分别升高59*%(P<0*1)和36.8%(P<0*5);转 染 SpJp3表达载体后,随着即 l表达水平的增加,端粒酶活性和 hTERT < RNRNA水平明显增加,增加率分别为38.5WP<0刀5)和25.4%0<0刀5L 而即3表达载体对端粒酶活性和hTERT m洲A水平无明显影响。O)浓 。度从 0二52刀 u mol·L”l时,反义 Spl对细胞的增殖抑制作用随 剂量增加而增强,与反义 C-MyC ODN比较,有较好的量效关系,但各浓 度组的抑制作用比反义 c-Myc ODN低;而 2刀 u m*·LI浓度的反义 C-MyC、Spl ODN转染 Jurkat T细胞 24h、48h和 72h后,对细胞增殖抑 制作用的时效关系表明,反义C-MyC ODN比反义Spl ODN起效快,作用 强。归)2.5 n g砌l的 PHA刺激 Jurkat T细胞时,端粒酶活性增加了 5080%o叱刀匀;ras负突变表达载体 pZIPrasl7N和 raf负突变表达载体 pCGNraf(l)转染使PHA刺激的端粒酶活性分别降低了38.7%o刃刀5) 和 34.3%(P<0刀匀。(6)转染 1刀 n mol·L”‘反义 H-rs ODN和反义 c一raf ODN有效抑制 H-rs mRNA和 c-raf mRNA表达,抑制率分别为 52.l%(P<0*1)和 42.8%(P<0*1);不同浓度的反义H-ras ODN和反义c-raf ODN明显抑制 PHA诱导的端粒酶激活,浓度从 0.5 u mol·L“l至 2刀 u mol 工’时,抑制率分别从 19*%升高至68.6%和从20刀%升高至67刀%, 表现出明显的剂量依赖性<7)用 10 u mol“’的 PD98059J刀卜 mol” U0126和 5 n mol .L’l的 Bisindolylmaleimide分别抑制 MEKI、MEKllZ 和 PKC,使 2.5 P g/mlPHA刺激的 JUrkat T细胞端粒酶活性分别降低了 37.2WP<0*5)、64.7WP<0*1)禾SO.5地P<0*1)。 结论:*)Spl和C-MyC转录因子通过促进hTERT表达水平共同调节 Jurkat T细胞端粒酶活性,但Spl在hTERT转录调控中更为重要八2)SP3 对hTERTInRNA的转录水平虽有一定的抑制作用,但不影响端粒酶活性, 表明即3不是端粒酶活性的负调控因子叶)反义 c-Myc对 Jurkat T细胞 4 第一军医大学博士学位论文 增殖抑制作用不是通过抑制端粒酶活性引起的。O)PHA主要通过 RasKafMEKERK信号途径激活 Jurka T细胞端粒酶/5)PKC对端粒酶 活性的调节作用是双重的,一方面促进端粒酶生成,另一方面增强其功能。 …)反义SPI ODN抑制端粒酶活性,进而抑制肿瘤生长,预示其可作为 一种潜在的抗肿瘤新策略。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R346

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 吴翔,朱冰,杨光彩,徐钤;人成纤维细胞转染HPV16型早期蛋白基因后端粒酶的活性表达[J];第一军医大学学报;1999年05期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 庞建新,吴曙光;端粒酶逆转录酶(hTERT)的分子调节机制[J];第一军医大学学报;2001年02期
2 邓守恒;俞远东;张军;李芳;邰云燕;陈萍;徐华;;硒化壳聚糖诱导NB4细胞分化作用的研究[J];山西医药杂志;2010年10期
3 李广远;陈彻;楚惠媛;;红芪总黄酮对人白血病细胞诱导分化的影响[J];中国中医药信息杂志;2008年07期
4 邓守恒;张春香;曾小华;蔡晓军;李林均;陈萍;;硒化壳聚糖对HL60细胞增殖分化的影响[J];江苏医药;2010年10期
5 邓守恒;李程;杨君君;邱美红;吴松松;陈萍;;硒化壳聚糖对HL60细胞的诱导分化作用[J];中国药房;2010年09期
6 王志红;林菁;;盐酸小檗碱对HL-60细胞的诱导分化及其作用机制[J];中国药科大学学报;2006年02期
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1 王志红;;小檗碱对HL-60细胞的诱导分化作用及其机制研究[A];第十届全军检验医学学术会议论文汇编[C];2005年
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1 任琛琛;HPV_(16/18)感染、PCNA表达及端粒酶活性在子宫颈癌发生发展中相关性的研究[D];郑州大学;2002年
2 樊昕;外阴营养不良和外阴鳞癌中端粒酶逆转录酶TERT和c-myc基因蛋白表达及相互关系研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
3 王志红;盐酸小檗碱的抗肿瘤作用及对HL-60细胞的诱导分化[D];福建医科大学;2004年
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1 李勇年;一种新型表达载体——胞浆表达系统[J];国外医学.分子生物学分册;1995年06期
2 王熙才;基因重组构建MDR基因表达载体及其表达研究[J];昆明医学院学报;1995年02期
3 韩保光,孟莉,马贤凯;与ColE1相容的高效表达载体的构建及用于HIV-1蛋白酶在大肠杆菌的表达[J];军事医学科学院院刊;1997年03期
4 郝春秋,周永兴,冯志华,李谨革,贾战生,王平忠;HCV结构基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-S的构建、鉴定及表达[J];医学研究生学报;2001年05期
5 曾霞;王树声;毕胜利;周永东;张涛;刘敏;王昭孝;;伯氏疏螺旋体外膜蛋白A的表达及纯化[J];中华慢病杂志;2003年01期
6 喻华英,王景林,高丰,康琳,吴东林,赵金红;志贺毒素B(ShT-B)亚单位在两种表达载体中表达形式的分析[J];中国人兽共患病杂志;2004年08期
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8 侍晓云,畅继武,邱明才;葡萄糖调控的胰岛素原真核表达载体的构建[J];武警医学院学报;2005年04期
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3 刘晓艳;方红;羊正纲;张好;阮黎明;蒋筱凌;;HPSE基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年
4 迟灵芝;刘茂军;冯志新;单虎;邵国青;;猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年
5 吴红联;;5-脂氧化酶基因真核表达载体的构建与鉴定[A];第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)论文摘要汇编[C];2009年
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7 马立新;陶然;张娟;;一步法构建重组腺病毒表达载体[A];中国蛋白质组学首届学术大会论文摘要集[C];2003年
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9 杜爱芳;李孝军;侯玉慧;;捻转血矛线虫(H.contortus)ZJ株15kDa分泌排泄(ES)蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C];2004年
10 严力行;许先国;朱发明;何吉;;RHD基因的克隆及其在K562细胞中的表达[A];中国输血协会第三届输血大会论文专辑[C];2004年
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1 张中桥;第四军医大学西京医院实现肿瘤特异性RNA干扰[N];中国医药报;2006年
2 颜莘;国产转基因抗虫棉打破国外垄断[N];中国知识产权报;2007年
3 张中桥;四医大西京医院发现 FAS启动子具有肿瘤靶向性[N];中国医药报;2007年
4 本报记者 刘河 于益江 刘仁;回眸“十五”中国专利奖[N];中国知识产权报;2006年
5 双华斌;爱,竟让我们如此感动[N];中国教育报;2008年
6 朱恒顺;山大一项免疫学成果通过鉴定[N];科技日报;2002年
7 张中桥;FAS启动子 肿瘤细胞的探测器[N];健康报;2007年
8 魏衍亮;转基因棉花产业需要专利护航[N];中国知识产权报;2006年
9 张中桥;NDRG2可诱导肝癌细胞HepG2凋亡[N];中国医药报;2004年
10 庄愉;基因疫苗研究的第三次革命[N];医药经济报;2001年
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1 史红艳;柯萨奇病毒B4单、双siRNA表达载体的构建及其抗病毒作用研究[D];吉林大学;2006年
2 许雷;大青杨纤维素合酶基因的克隆与遗传转化的研究[D];东北林业大学;2011年
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4 乔玉山;砂梨果实成熟软化相关基因的克隆、表达分析及其表达载体的构建[D];南京农业大学;2009年
5 王虹;Rac1对卵巢癌细胞Skov3迁移与侵袭的影响及机制探讨[D];吉林大学;2012年
6 孙全喜;超长链多不饱和脂肪酸合成相关酶基因的克隆与鉴定及其在作物中的异源合成[D];山东农业大学;2011年
7 周世水;重组人源抗HBsAg单链抗体—干扰素γ在巴氏毕赤酵母中表达的研究[D];华南理工大学;2003年
8 李大可;RNA干扰表达载体抑制宫颈癌HPV16-E6基因表达的研究[D];四川大学;2005年
9 邓海军;MicroRNA-338-3p前体及其抑制剂的慢病毒表达载体的构建和初步功能性分析[D];南方医科大学;2013年
10 朱玥璐;miR-181a表达载体的验证及其对胰腺癌细胞生物学行为的影响[D];北京协和医学院;2009年
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1 王海萍;重组线虫抗凝肽的表达与纯化[D];安徽医科大学;2005年
2 陈瑶;大腹园蛛拖丝蛋白基因的克隆和序列分析[D];东华大学;2007年
3 张琳琳;蜡样芽孢杆菌工程菌的构建及α-淀粉酶基因的表达[D];内蒙古农业大学;2007年
4 单连慧;重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究[D];吉林大学;2004年
5 崔婷;重组嵌合毒素DAB_(389)-IL2的质粒构建,表达纯化及其mPEG化修饰的研究[D];吉林大学;2005年
6 任道锋;旋毛虫43kDa抗原基因重组质粒pET30a(+)-Ts43的构建与表达[D];郑州大学;2006年
7 孟凡红;重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化[D];大连理工大学;2006年
8 余国武;腊梅脂转移蛋白基因克隆与功能的初步分析[D];西南大学;2007年
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