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带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损的生物学特性研究

魏宽海  
【摘要】: 目的 (1)制作带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损的实验动物模型,探讨带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损的可行性及骨骼肌的变化。(2)获取并培养骨骼肌卫星细胞,探讨其正常的分化方向。(3)观察BMP对骨骼肌卫星细胞粘附、增殖及分化等生物学特性的影响,以探讨带血供肌瓣作为BMP载体修复骨缺损的细胞生物学机制。(4)探讨逆转录病毒介导hBMP7基因转染骨骼肌卫星细胞的方法及可行性。 方法 (1)制作兔桡骨中下段15mm骨—骨膜完全性缺损,将去神经化的指深屈肌肌瓣转位至缺损区,作为BMP载体来修复骨缺损,通过大体、X线、组织学、TUNEL染色、电镜等方法观察成骨过程及骨骼肌的转归。(2)取大鼠肱三头肌,采用二步消化法分离骨骼肌卫星细胞,体外进行原代培养和传代培养。通过生长曲线、细胞融合率研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。(3)用含BMP浓度分别为0、50、100、500、1000 μg/L的培养基进行培养,通过荧光法测定接种后1h的粘附细胞率,利用放射免疫法测定细胞层粘连蛋白的含量;通过MTT法测定细胞的增殖;通过HE染色观察细胞融合率;利用NPP法检测细胞ALP活性的改变;通过3H-脯氨酸掺入实验测定细胞胶原蛋白合成量;通过放射免疫法检测骨钙素含量的变化;通过RT-PCR检测细胞内ALP、Ⅰ型胶原蛋白、0C、0P等成骨细胞特异性蛋白在mRNA水平的表达。(4)制备含hBMP7基因的重组逆转录病毒液,感染骨骼肌卫星细胞,使用RT-PCR方法检测hBMP7在转染细胞中mRNA水平的表达。 结果 (1)骨骼肌逐渐发生萎缩,2 w时肌瓣内可触及串珠状团块,有大量软骨细胞生成,沿肌间隙分布。6 w时骨桥与宿主骨紧密结合,软骨溶解区有大量编织骨形成,出现骨髓腔并与宿主骨髓腔再通。8w时骨骼肌纤维几乎完全消失,新生骨组织呈条索状桥接两断端。组织 学显示骨骼肌萎缩的同时,部分细胞核出现崩解,并有凋亡小体出现; TUNEL染色呈阳性,电镜观察细胞呈典型的凋亡样改变。(2)采用二步 消化法可成功分离获得大鼠骨骼肌卫星细胞,在生长培养基作用下,细 胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。骨 骼肌特异性蛋白a-sarcomet,ic actin和 myosin兔疫化学染色显不, 骨骼肌卫星细胞弱阳性,肌管强阳性。()BMP叮促进骨骼肌卫星细胞 的粘附,在 500 u g/L的浓度时粘附率最高,BMP诱导后可促进骨骼肌 卫星细胞层粘连蛋白的表达,当BMP浓度为500 p矿L时这种作用最强: BMP可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,并随BMP浓度的增加这种作用愈发 明显;BMP可降低骨骼肌卫星细胞的细胞融合率,增强骨骼肌卫星细胞 的ALP活性,增加其胶原蛋白及骨钙素的含量;BMP可诱导骨骼肌卫星 细胞在 mRNA水平上表达 1型胶原蛋白、骨钙素和骨涎蛋白。(4)经病毒 液感染的骨骼肌卫星细胞中RT-PCR检测显示有hBMP mRNA的表达。 结 论(1)带血供肌瓣可作为 BMP的良好载体用于构建血管化的 骨组织来修复骨缺损。(2)体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的生长 与分化能力,适用于进一步的实验研究。()BMP可增强骨骼肌卫星细 胞的粘附能力,其机制与层粘连蛋白的表达增高有关:SMP可促进骨骼 肌卫星细胞的增殖,抑制其成肌表型而促进向成骨细胞分化。(4)采用 逆转录病毒介导的方法可以将hBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中,转人基 因可在mRNA水平上有效表达。


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