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《第一军医大学》 2002年
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表达幽门螺杆菌粘附素保守区的减毒鼠伤寒沙门菌的构建及其免疫治疗作用的研究

白杨  
【摘要】: 背景/目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃腺癌、胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生亦密切相关。临床实践证明,消化性溃疡愈合后Hp仍(+)者一年复发率达50%以上;根除Hp后不仅溃疡可以愈合,而且一年复发率可降至10%以下。此外,根除Hp后可以治愈MALT淋巴瘤。然而目前根除Hp的主要手段是抗菌疗法,尽管有较高的根除率,但存在诸如费用较高、耐药菌株的不断增加致根除率逐年降低、药物的副作用以及病人的依从性差等问题,并非理想的治疗方法。随着Doige等在1994年发现Hp疫苗的治疗作用后,免疫防治Hp成为治疗Hp最有希望的方法之一。鉴于Hp已证实的四种粘附素保守区(AB)是外膜蛋白(OMP)和膜孔素(porin)样成分,而外膜蛋白和膜孔素样成分是优秀的疫苗候选抗原。因此本研究的目的是:选择暴露于Hp表面的AB为抗原,首先通过基因工程技术将保守区基因克隆入原核表达载体并在大肠杆菌中表达,表达产物经过纯化后在体外探讨其安全性、免疫原性和生物活性;进一步将保守区基因克隆入减毒鼠伤寒沙门菌平衡-致死系统,在已感染Hp的小鼠模型中研究其免疫治疗效果,以及可能的免疫治疗机制,以确定AB及表达AB的减毒鼠伤寒沙门菌在Hp疫苗研制中的应用价值。 方法:(1)运用PCR技术从Hp总DNA中扩增出AB结构基因,装入pET-22b(+)载体进行序列及生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用金属螯合亲和层析(MCAC)的方法纯化表达产物AB,免疫印迹法检测其抗原性;(2)二苯胺(DPA)法和流式细胞术检测AB致人外周血淋巴细胞(PBL)凋亡的作用,体外评价AB的安全性;光镜计数法研究AB抗体对Hp与胃癌细胞粘附的影响;ELISA法测定Hp感染者血清中抗AB抗体,MTT法测定PBL对AB的增殖反应,体外评价AB对体液和细胞免疫的影响;(3)采用缺失腺苷酸环化酶(Δcya)、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶(Δasd)的鼠伤寒沙门菌 比4072)作为宿主,将编码 AB的基因插入 ASd”的组成型表达载体 PYA248,通过两次转化引入宿主菌,构建了表达AB基因平衡致死的减毒 鼠伤寒沙门重组菌X4072(PYA248-AB),采用桥联法ELISA测定X4072 (pYA248-AB)培养上清液和裂解上清液中 AB的抗原性,参照 Meacock 叙述的方法及重组菌的生长曲线的测定来确定重组菌株的稳定性,通过 C57BL巧小鼠口服测定半致死量来确定重组菌的安全性;④建立 Hp感 染小鼠模型,在该模型中评价 X4072(PYA248-AB)治疗 HP感染的效果, 运用细菌培养法观察HP根除率及定植量的改变,流式细胞术分析免疫后 小鼠脾细胞亚型,ILZ和 IL4细胞依赖株的细胞测活法检测细胞因子, ELISA 法检测小鼠血清及肠液中抗AB抗体产生情况,探讨X4072 (PYA248-AB)可能的免疫治疗机制。 结果:*)成功构建了AB的重组质粒pET22b卜*/AB,序列分析显示 获得了一段588hP的基因,完整的包含了粘附素C-端的7个保守区。 Parker法和Welling法分析显示AB具有良好的抗原性和疏水性。进一 步应用 INTERNET EXPASY、NNPREDICT、ISREC等生物信息软件分析,发 现其为膜孔素样结构,是跨膜区膜外区域的重要表位组成部分。在 Genebank中BLAST分析了836767个蛋白序列,与其具有同源性者均为 HP外膜蛋白序列。蛋白电泳分析和凝胶扫描表明获得了高效表达AB的 克隆株,其分子量为22.shD,占菌体总蛋白的29.6儿 其中可溶性表达 占上清的21.9%,纯化后获得纯度达卯%的重组蛋白AB,免疫印迹显示 该蛋白可被AIPA兔抗血清和HP感染患者的血清抗体识别;狸)体外安全 性实验表明AB无明显调节PBL细胞表达FasL和致PBL细胞凋亡的作用; ELISA法共检测了55份血清,同时以RUT作为平行对照,两法的评价判 断一致性(agreement)程度的指标卡帕系数(KaPPa值)为0.76,同 时,低剂量 AB即可刺激 HPPBL的增殖;AB抗血清能部分阻断 Hp与胃癌 细胞系的粘附,在光镜下表现为经抗AB兔血清预处理后,每细胞周围粘 附的细菌数较免疫前兔血清预处理组显著减少…m.05\ ①成功构建 了表达AB 的减毒鼠伤寒沙门菌重组菌株S.tyPhimurium X4072(pYA248-AB),桥联法ELISA测定表明重组菌X4072(PYA248-AB) 培养上清中AB的含量高于菌体裂解液,重组菌PYA248{B在没有选择压 -2- 力的情况下培养100代,随机挑选的重组菌全部都能生长,且在ELISA 测定妞抗原时均显阳性。重组菌的生长曲线测定表明,X4072叩YA248) 和X4072(wAZ抡-AB)的生长状态基本一致;口服 重组菌株 X4072(PYA248-AB)1.OX 10“CfU.30天后,C57BL/6存活率仍为 100%。(4) 免疫治疗后疫苗治疗组根除率为53.3兄 显著高于其它两组…州.of人 未根除HP的小鼠,疫苗治疗组伽的定植密度明显低于其它两组 h州.of人应用流式细胞仪分析免疫小鼠脾CD4*CDS*淋巴细胞的比值
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R573

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 白杨,张亚历,王继德,杨云生,张兆山,周殿元;幽门螺杆菌粘附素基因alpA的克隆与高效表达[J];第四军医大学学报;2002年16期
2 陈烨,张兆山,王继德,周殿元;幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达[J];第一军医大学学报;2000年03期
3 白杨,张亚历,王继德,杨云生,陈烨,张兆山,周殿元;幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆、表达及免疫原性研究[J];第一军医大学学报;2002年01期
4 林珊珊;幽门螺杆菌耐药机制的研究进展[J];国外医学(流行病学传染病学分册);2003年01期
5 邵圣文;淋病奈瑟氏球菌对喹诺酮类药物耐药机制的研究进展[J];国外医药(抗生素分册);2001年01期
6 滕家波,苏国富;载体—宿主平衡致死系统在减毒伤寒沙门氏活菌苗中的应用[J];国外医学(免疫学分册);1999年03期
7 唱韶红,熊凌霜;对IL-4两种测活方法的比较及MTT法最适条件确定[J];免疫学杂志;2000年04期
8 郭红,邹全明,赵哓晏;幽门螺杆菌疫苗免疫机制的研究进展[J];免疫学杂志;2001年S1期
9 白杨,张亚历,王继德,李淑琴,张兆山;幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆及序列分析[J];中国生物制品学杂志;2002年02期
10 鲍朗,晏菊芳,胡昌华,谢勇恩,邱洪宇,张会东;中国强毒力赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因的克隆表达及对大肠杆菌活力的影响[J];中国病理生理杂志;2001年08期
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1 蒋定文;胸腺基质细胞对热应激小鼠胸腺细胞调节作用的研究[D];第一军医大学;2000年
【共引文献】
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1 谢永芳,舒坤贤,梁亦龙,袁帅,张继承;小鼠胚胎发育中期肠细胞增殖与凋亡的研究[J];癌变.畸变.突变;2005年01期
2 王子良,许丽艳,李恩民;质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响[J];癌变.畸变.突变;2005年02期
3 康振桥;季艳霞;杨志勇;苏光;崔彦芝;;血管内皮生长因子亚型在人乳腺癌细胞中的表达差异[J];癌变.畸变.突变;2006年03期
4 安刚;黄天华;谢庆东;王德刚;;pCXN2-mIZUMO对C57BL/6小鼠生育能力的影响[J];癌变.畸变.突变;2007年04期
5 朱斌;杨罗艳;赵晓昆;;膀胱癌多药耐药基因MDR-1与金属硫蛋白-3表达的关系[J];癌变.畸变.突变;2007年05期
6 毕玉平,廖俊杰,单雷,王兴军,徐平丽;番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究[J];山东农业科学;1997年06期
7 单雷,毕玉平,王兴军,徐平丽,李广存;双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析[J];山东农业科学;1998年04期
8 葛宏华,孙莉宁,张其瑞;家蚕血淋巴蛋白的发育变化和BmLSP的纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);2001年03期
9 韦传宝;贾玉成;杜宇;;芋花叶病毒检测试剂盒的研制[J];安徽大学学报(自然科学版);2009年04期
10 张运锋;黄光和;李希国;谭学林;;普通菜豆农艺性状相关性分析及主成分分析[J];安徽农学通报;2008年07期
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1 徐义流;张绍铃;;梨活体花柱内花粉RNA的降解[A];食品安全的理论与实践——安徽食品安全博士科技论坛论文集[C];2005年
2 崔梅花;;中药荆花胃康联合质子泵抑制剂三联疗法根除幽门螺杆菌感染的研究[A];第二十七届航天医学年会暨第十届航天护理年会论文汇编[C];2011年
3 王春花;成军;郎振为;吴煜;杨艳杰;张黎颖;刘妍;;基因表达谱芯片技术筛选XTP3蛋白反式调节基因[A];第一届全国人工肝及血液净化学术年会暨全国人工肝及血液净化攻关协作组成立大会论文集[C];2004年
4 唐南洪;王晓茜;李秀金;陈燕凌;;构建特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因(hGS)的肝细胞[A];第三届全国重型肝病及人工肝血液净化学术年会论文集(上册)[C];2007年
5 陈秀蓉;杨成德;贾迎春;;西瓜细菌性果斑病菌的分离鉴定[A];节能环保 和谐发展——2007中国科协年会论文集(三)[C];2007年
6 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
7 李智媛;屈淑平;崔崇士;;美洲南瓜AFLP反应体系的优化与建立[A];中国园艺学会南瓜分会西南地区南瓜产业化发展研讨会暨第三届会员代表大会论文集[C];2009年
8 李青;钟青萍;王丽;;海产品中副溶血弧菌的PCR快速检测方法的建立[A];“食品加工与安全”学术研讨会暨2010年广东省食品学会年会论文集[C];2010年
9 谈安群;钟广炎;江东;闫虎斌;王淼;;用抑制性消减杂交法分离兴春椪柑干旱胁迫诱导表达的cDNA[A];中国柑橘科技创新与产业发展战略论坛暨中国柑橘学会2007年年会论文集[C];2007年
10 杨桂彬;魏红;牟方宏;;安速快速检测试剂盒诊断幽门螺杆菌现症感染的临床研究[A];第二十三届航天医学年会暨第六届航天护理年会论文汇编[C];2007年
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1 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
2 张升祥;家蚕气味结合蛋白基因的研究[D];山东农业大学;2009年
3 李振东;东祁连山高寒草地优势植物内生细菌多样性研究[D];甘肃农业大学;2010年
4 姚小磊;基于TGF-β1与Bcl-2的抗干眼症中药高通量筛选体系的建立[D];湖南中医药大学;2010年
5 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
6 温武军;鲤抗菌肽基因的克隆及其功能研究[D];山东师范大学;2011年
7 郭忠鹏;代谢工程改善工业酒精酵母发酵性能[D];江南大学;2011年
8 孙亚妮;免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用[D];山东农业大学;2011年
9 郭洪亮;siRNA-smad3对缺血性脑损伤ActA/smads信号转导通路的影响[D];吉林大学;2011年
10 斯庆图娜拉;不同慢性胃病来源HP的耐药特征及抗HP嗜酸乳杆菌的抑制效应分析[D];吉林大学;2011年
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1 郑瑜;银杏核心种质构建初探[D];华中农业大学;2010年
2 赵兴华;IL-6与GM-CSF基因融合表达生长抑素基因疫苗对小鼠生长的影响[D];华中农业大学;2010年
3 曹晶;风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达[D];南京医科大学;2009年
4 罗素娟;家蚕细胞周期依赖性蛋白激酶家族(CDK)的研究[D];浙江理工大学;2010年
5 陈晓平;家蚕30kD载脂蛋白19G1的表达和功能的初步研究[D];浙江理工大学;2010年
6 刘静;家蚕BmycaCR基因的原核表达和亚细胞定位研究[D];浙江理工大学;2010年
7 费晶晶;两个家蚕FKBP12基因的研究[D];浙江理工大学;2010年
8 葛红秀;家蚕钙磷蛋白(BmCAPS)的原核表达及定位分析[D];浙江理工大学;2010年
9 梁莉惠;家蚕BmCH基因的原核表达和亚细胞定位研究[D];浙江理工大学;2010年
10 梁晓艳;人脂联素基因的原核表达纯化、抗体制备及应用[D];郑州大学;2010年
【二级参考文献】
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1 王斌,邵一鸣,曾毅;HIV-1SF2株env基因(120)在大肠杆菌中的表达[J];病毒学报;1996年01期
2 舒石庄,陈慰峰,刘祝公,张平夏,吴江声;八株小鼠胸腺基质细胞系的建立及鉴定[J];北京医科大学学报;1993年04期
3 郑春福;热休克蛋白在传染病中的免疫保护作用[J];国外医学.流行病学传染病学分册;2000年04期
4 谷文萍;热休克蛋白70研究进展[J];国外医学.神经病学神经外科学分册;1999年02期
5 乐军,胡宏;Fas抗原分子[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1996年05期
6 王枫;热休克蛋白与热耐力研究进展[J];国外医学(卫生学分册);1997年02期
7 郑磊,颜晓慧;热应激时热休克蛋白70及其细胞保护作用[J];国外医学(卫生学分册);1999年04期
8 Lawzence.E.Bryan;陈瑾壁;;抗生素的耐药机理[J];国外医药(抗生素分册);1990年04期
9 席允平,王华梁;T细胞在胸腺中的阳性选择及其意义[J];国外医学(免疫学分册);1997年02期
10 郑秀娟,董玮,何球藻;小鼠的B淋巴细胞分离法——单克隆抗体清除法和尼龙毛柱纯化法的比较[J];上海免疫学杂志;1989年04期
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1 刘正祥,邹全明,洪愉,朱永红;重组幽门螺杆菌粘附素工程菌高密度发酵条件的研究[J];第三军医大学学报;2004年15期
2 Ruoslahti E;Giancotti FG;官奇;;粘附素与肿瘤细胞扩散[J];国际输血及血液学杂志;1991年03期
3 郑铃,洪新如,陈豪,郑秀芬,陈锦英;致肾盂肾炎大肠埃希菌粘附素重组蛋白诱导小鼠免疫应答[J];中国人兽共患病杂志;2004年10期
4 Thorms C.J. ,蒋仲芳;用于预防牛肠炎的商品菌苗中K_(99)(F_5)纤毛粘附素的鉴定[J];微生物学免疫学进展;1991年02期
5 ;泌尿道病原性大肠埃希氏菌Dr粘附素的表达与抗生素耐药性的相关性[J];国外医药.抗生素分册;2001年05期
6 张道理;王继德;;幽门螺杆菌粘附素的研究进展[J];国外医学(微生物学分册);1998年05期
7 陈烨,张兆山,王继德,周殿元;幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达[J];第一军医大学学报;2000年03期
8 闫文生,姜勇;钙依赖性粘附素及其信号转导[J];生理科学进展;2000年04期
9 白杨,王继德,林焕建,张兆山,张亚历;幽门螺杆菌粘附素基因babA_2的克隆及免疫应答的初步研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2003年04期
10 白杨,唱韶红,王继德,陈烨,张兆山,张亚历;表达幽门螺杆菌粘附素BabA重组蛋白菌株的构建及其粘附活性评价[J];第一军医大学学报;2003年04期
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1 王瑜;雷连成;韩文瑜;李林溪;谢芳;;胸膜肺炎放线杆菌三聚体自转运粘附素N端基因序列和功能区的分析[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
2 孟怀旺;蓝洪;米自由;范首君;苏军;;乳杆菌抗病机制研究进展[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年
3 方瑶;顾江;于波;王海光;毛旭虎;;类鼻疽伯克霍尔德菌粘附素1434基因的克隆表达及免疫学性质鉴定[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
4 陈烨;王继德;叶桂安;张亚历;周殿元;;幽门螺杆菌重组粘附素rHpaA免疫保护作用的动物实验研究[A];中国中西医结合学会第十二次全国消化系统疾病学术研讨会论文汇编[C];2000年
5 李扬;韩文瑜;雷连成;石蕾;;GST-MrkD融合蛋白的表达纯化、鉴定及其粘附活性研究[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008)[C];2008年
6 陈烨;王继德;周殿元;张兆山;;幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、序列分析及原核表达[A];中国中西医结合学会第十二次全国消化系统疾病学术研讨会论文汇编[C];2000年
7 陈烨;周殿元;王继德;叶桂安;梁卫江;;幽门螺杆菌重组粘附素HpaA生物学活性及免疫原性的体外研究[A];中国中西医结合学会第十二次全国消化系统疾病学术研讨会论文汇编[C];2000年
8 斯大勇;张日俊;;乳酸菌粘附机制研究进展[A];第三届第八次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集[C];2006年
9 袁万哲;何孔旺;陆承平;郝勤宗;裘孝良;左玉柱;;仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗的研制Ⅳ疫苗生产与免疫效力试验[A];河北省畜牧兽医学会2004年学术年会论文集[C];2004年
10 刘青涛;杨保收;冯秀丽;张俊平;梁武;李守军;;仔猪黄痢研究进展[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008)[C];2008年
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1 小雪;污染饮水和食物的罪魁——大肠杆菌[N];中国医药报;2004年
2 范高明;艾格生蛋黄免疫球蛋白 筑起国民免疫新长城[N];中国高新技术产业导报;2003年
3 记者 李水根 通讯员 施水泉;婴幼儿顽固性腹泻病因找到[N];健康报;2001年
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1 郑铃;致肾盂肾炎大肠埃希菌粘附素基因papG的克隆表达及其免疫保护作用的初步研究[D];天津医科大学;2003年
2 钟世顺;双歧杆菌分泌型粘附素体外调节肠上皮细胞生物学功能的实验研究[D];第一军医大学;2004年
3 陈烨;幽门螺杆菌粘附素HpaA的克隆、表达及其免疫原性和保护性研究[D];第一军医大学;2000年
4 白杨;表达幽门螺杆菌粘附素保守区的减毒鼠伤寒沙门菌的构建及其免疫治疗作用的研究[D];第一军医大学;2002年
5 杨宏军;奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌毒力因子的克隆表达及生物活性研究[D];山东农业大学;2007年
6 何佳燕;粘附素及其他致病相关因子在中间普氏菌与人上皮细胞互作中的作用研究[D];浙江大学;2010年
7 刘淑杰;大肠杆菌粘附素亚基FaeG在Lactococcus lactis中的表达及免疫原性研究[D];江南大学;2010年
8 于宏;胆道感染细菌与机体相互作用机制的实验研究[D];中国医科大学;2008年
9 刘鑫;猪肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4受体相关候选基因的筛选与表达研究[D];湖南农业大学;2008年
10 陈志明;串联亲和纯化与质谱技术对Mde4、Swi5、Sfr1蛋白复合物的鉴定[D];吉林大学;2009年
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1 吴学敏;嗜水气单胞菌主要粘附素基因序列及其重组基因表达产物功能分析[D];福建农林大学;2010年
2 袁万哲;仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗的研制[D];南京农业大学;2004年
3 吴利先;幽门螺杆菌HpaA-CtxB融合蛋白的研制及免疫原性研究[D];重庆医科大学;2004年
4 张际青;粘附素-5 N端CED-4基因转染及其对MDA-MB-435细胞增殖影响的研究[D];江西医学院;2004年
5 范贵荣;抗幽门螺杆菌VacA和HpaA双特异性单克隆抗体的制备[D];重庆医科大学;2009年
6 王念;肺炎克雷伯杆菌粘附作用与细菌毒力相关性的初步探讨[D];四川大学;2006年
7 李振;猪唾液酸粘附素抗原表位蛋白在大肠杆菌体内的表达及其多克隆抗体的制备[D];河北农业大学;2012年
8 王英杰;奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌相关毒力因子的研究[D];山东师范大学;2008年
9 栗俊杰;幽门螺杆菌重组HpaA蛋白的表达及其包涵体纯化方法的探讨[D];重庆医科大学;2008年
10 罗艳茹;仔猪大肠杆菌F18粘附型与FUT1基因型相关性研究[D];甘肃农业大学;2007年
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