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《第一军医大学》 2002年
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抗人乳头瘤病毒16型E6核酶对宫颈癌细胞株端粒酶活性和放化疗敏感性的影响

饶智国  
【摘要】: 背景 人乳头瘤病毒(HPVs)是一种小的DNA肿瘤病毒,它可以感染上皮细胞,引起细胞的增生性病变。大量的体内外的流行病学研究显示,某些特异的HPV感染可以导致上皮细胞的恶性变。90%以上的宫颈癌HPV阳性。大多数这些病变是粘膜相关的高危HPV亚型所致。HPV感染是宫颈癌最主要的致病因素,E6是主要的致癌基因之一,高危HPV基因型,如HPV16的E6蛋白表达水平是维持宫颈癌恶性表型的必要条件。近年来,一种被称为核酶的新的遗传学工具被发现。核酶是一种具有催化活性的RNA分子,它不仅具有反义核酸与靶RNA特异性结合的功能,同时具有酶的催化特征,可以特异性地切割靶RNA分子。放射治疗是目前宫颈癌治疗的标准和有效的方法;化疗作为一种辅助治疗手段近年来越来越受到重视。将基因治疗、放疗、化疗相结合为宫颈癌的治疗提供了一个新的研究思路和方法。 目的 本研究通过脂质体法将抗HPV16E6核酶(ribozyme)转染入宫颈癌CaSKi细胞,研究该核酶对宫颈癌CaSKi细胞的恶性表型、端粒酶活性和放化疗敏感性的影响和基因调控机制,旨在探讨HPV的致癌机制,寻找一种有效的核酶与放、化疗相结合的宫颈癌治疗方法。 方法 1.以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分 第一军医人学博士学位论文 别命名为CaSKi-R、CaSKiP细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达, Northern杂交检测H种细胞中E6基因的表达。 2.观察了三种细胞的形态,测定三种细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成 率,流式细胞仪检测了三种细胞的细胞周期变化。 3.用TRAP七LISA法定量检测了三种细胞的端粒酶活性,流式细胞术和 RT-PCR检观了p53、c-myc、bclZ基因和蛋白的表达。 4.采用MTT比色法和克隆形成试验检测了在体外放化疗对三种细胞的 细胞毒作用,抗 HPV 6E6核酶对宫颈癌细胞放化疗敏感性的影响;裸鼠 移植瘤生长分析检测了三种细胞在裸鼠体内对化疗药物顺铂敏感性。 5.Annexine叩I双标法、细胞总DNA琼脂糖凝胶电泳检测三种细胞处理 前和放化疗后凋亡率的变化,透射电镜观察了三种细胞在X线照射后和 顺铂处理后的超微结构改变。 6、用流式细胞术和 western blot法分别检测了三种宫颈癌细胞放化疗前 后的bCI-2、P53、b狐、C-myC、CCpase3蛋白表达。RT-PCR法检现了三 子细胞bclZ、p53、bax、c-myc、hTR、hTERT基因表达。 结果 1.用脂质体法将抗HPV16E6核酶转染入宫颈癌CaSKi细胞后,用点杂交 证实核酶能在 CaSKiK细胞中稳定表达。用 N。them blot、流式仪和 western blot法证实CaSKi.R细胞的HPV16E6的表达量较CaSKi-P、CaSKi 细胞明显降低。 2.三种细胞的形态没有明显差异;CaSKiP、CaSKi细胞比较,CaSKIR 细胞生长速度较明显减慢,软琼脂克隆形成率显著降低。 3.CaSKiE细胞较CaSKiP、CaSKi细胞的端粒酶活性明显降低,p53 蛋白表达增加,bclZ、c-myc蛋白表达减少;p53、hTR mRNA在三种 细胞中表达无差异,CaSXi-R细胞较CaSKiI、CaSKi细胞的hTERT、 be12、c-mvc mRNA表达减少。 4.X线照射后可以诱导三种宫颈癌细胞变圆,贴壁能力逐渐消失,细胞 体积变小,细胞核浓缩。与CaSKi-P、CaSKi细胞相比,CaSKi-R细胞变 化更明显。X线照射后三种细胞都出现明显的生长抑制,随着X线照射 o一 第一军医大学博士学位论文 剂量的增加和照射的培养时间的延长,对三种细胞的抑制率逐渐增加, 在各个照射剂量,射线对CaSKi-R细胞的抑制率都较CaSKi-P。CaSKi细 胞明显增加。与CaSKi-P、CaSKi细胞相比,在X线照射前后CaSKi干细 胞的克隆形成率明显减少,而凋亡率明显增加。CaSKi干细胞对射线的 敏感性较CaSKi-P、CaSKi细胞明显增加。 透射电镜观察CaSKi于细胞经X射线辐射后,大部分细胞凋亡; CaSKi-P、CaSKi细胞只见少部分细胞凋亡,调亡细胞胞核明显浓缩,染 色质凝聚可见凋亡小体形成。 CaSKIR细胞p53、bax蛋白表达率较CaSKi、CaSKiP的表达率明 显增高,而CaSKi《细胞bclZ、c-myc蛋白的表达较CaSKi、CaSKi干 的阳性率明显下降,p53、bax、hcf上和c-m印的表达阳性率在CaSKi。 CaSKi十间无显著差异。经 X线照射后 CaSKi报在分子量 3.2 X 104及 2 XIO‘处均可检测到蛋白条带而 CaSKi和 CaSKiF仅在分子量 3.2 XIO‘ 处出现蛋白条带,表明caspase3已被剪切为20Kda的有活性的蛋白酶。 与 CaSKi和 CaSKi-P相比,X线照射后 CaSKi-R细胞表达 p53 mRNA、 bax mRNA明显增加,be12、c-myc mRNA的表达量明显减少,而CaSKi 和 CaSKi干细胞表达的的3、bax、bclZ、c-myc mRNA无差异。 5.10种化疗药物对三种宫颈癌细胞均有一定的抑制作用,
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R737.33

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