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《第一军医大学》 2002年
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用腺病毒载体介导的基因转移研究HBV/C区热点变异对小鼠免疫应答的影响

刘志华  
【摘要】: 国内外的研究发现HBV/C区变异与病变重度相关,但两者之间的因果关系尚未确定。本研究以重组腺病毒为载体,将含有变异位点的HBV基因组转入HepG2细胞和BALB/C小鼠,从体内和体外研究变异位点的生物学意义,旨在阐明C区变异对宿主细胞免疫和体液免疫的影响。 1.重组腺病毒的构建 用定点诱变技术,以含有1.2拷贝HBV基因组的p3.8Ⅱ质粒为模板,构建含L60V和I97L的突变株。采用AdEasy系统构建重组腺病毒,以分子克隆手段将HBV基因组克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack上,重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转化大肠杆菌BJ5183细胞,通过同源重组获得重组腺病毒质粒,用Pac Ⅰ线性化后,转染293包装细胞,获得含野生型和变异型HBV基因的3种重组腺病毒。 2.重组腺病毒生物学特征的鉴定 电镜下观察到了重组腺病毒具有典型的腺病毒形态,直径约70nm。用PCR和Southern blot证实HBV DNA已整合入腺病毒基因组,有遗传稳定性:用RT-PCR检出HBV特异的mRNA,用ELISA在感染了重组腺病毒的293细胞的培养上清中检出了HBeAg。 3.HBV基因在HepG2细胞中的表达 用重组腺病毒感染HepG2细胞,分别用ELISA法和Western blot从细胞上清和细胞裂解物中检出HBsAg、HBeAg和HBcAg的表达。以不同传染剂量的重组腺病毒传染HepG2细胞,结果表明,传染剂量越大,分泌性抗原的表达越强,此外,还比较了相同传染剂量的各种重组腺病毒感染HepG2细胞后其抗原表达的动态变化,发现AdHBV-WT的HBeAg表达量始终高于2个变异株;AdHBV-WT和AdHBV-L60V的HBsAg的表达量接近,而AdHBV-I97L的HBsAg表达极弱。 4.重组腺病毒诱导BALB/C小鼠的免疫应答 用AdHBV-WT、AdHBV-L60V和AdHBV-I97L以滴鼻途径传染BALB/C小鼠,以接种野生5型腺病毒和生理盐水的小鼠为对照,观察HBV基因在小鼠体内诱发 的体液兔疫和细胞免疫应答。重组腺病毒感染的3组小鼠均能有效地产生抗.HBC 抗体,抗体水平无明显差别,所有小鼠血清中抗-HBs均阴性,仅有部分小鼠产生 了较弱的抗HBe抗体。检测小鼠血清中抗-HBc IgG抗体的亚类,结果表明 3个实 验组小鼠血清中 IgG和 IgGZa两种亚类抗体均为阳性,以 IgGZa占优势,说明腺 病毒诱导的对HBCAg的应答以Thl类免疫为主。比较3组实验小鼠IgGZa/IgGI的 比值,未发现有显著性差异,表明 L60V和 I97L变异可能不影响 Thl几hZ的分化 方向。分离小鼠脾淋巴细胞,体外用重组HBCAg刺激,以’H-TdR摄入法检测小 鼠T淋巴细胞的增殖反应,发现AdHBVWT感染组小鼠强于另2组小鼠,说明 AdHBVWT诱导小鼠产生HBCAg特异性T细胞反应的能力比AdHBVL60V和 AdHBV-197L的强。 结论:C区的2个热点变异L60V和I97L与野生型相比,诱发小鼠特异性T 细胞应答的能力较弱,变异位点可能通过改变免疫细胞识别表位而引起T细胞应答 降低,从而逃避宿主的兔疫反应。因此,我们推测L60V和I97L可能是免疫逃避 株。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R392.1

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【参考文献】
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