收藏本站
《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库的构建及大肠癌相关抗原的SEREX筛选

刘宇虎  
【摘要】: 背景、目的 大肠癌(colorectal cancer.CRC)是消化系统常见恶性肿瘤之一,发病率居全球最常见恶性肿瘤的第4位,是我国位居第4位的常见恶性肿瘤。20世纪90年代起,其发病率和死亡率呈逐年增高的趋势,发病年龄也趋于年轻化,在我国占癌症死亡的第5位。大规模的人群普查研究表明,35岁以上的人群中,大肠癌的发病率约为24~32例/10万人口。随着分子生物学、遗传学和生物技术的发展,近几年来我国在大肠癌的基础、临床和预防方面的研究取得了较大的进展。然而迄今对其发病、复发、转移机制的了解仍然十分缺乏。大肠癌的治疗是以手术为主的综合治疗,根治术后的化疗是大肠癌综合治疗的一个重要组成部分。对高危人群(年龄在40以上、有大肠癌家族史或肠息肉患者)进行普查能早期发现大肠癌,但大肠癌病变小时对身体的影响不大,临床无明显表现,CEA特异性又不高,结肠镜检查目前尚未普及,目前大肠癌的早期诊断还缺乏简易有效手段。寻找大肠癌的肿瘤标志物与特异抗原或相关抗原就显得十分重要,以能早期发现大肠癌,使患者早期接受手术治疗,以提高5年生存率。 cDNA文库的应用,为鉴定肿瘤抗原基因奠定了基础,近年发展的鉴定肿瘤抗原的血清学方法—重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术SEREX(serological identification of antigen by recombinant cDNA expression libraries),较直接地鉴定了肿瘤抗原。研究表明,通过构建cDNA文库,进一步筛选,是发现新的肿瘤标志物的有效途径。我们选取大肠癌患者的新鲜癌组织作为建库材料,以λTrip1Ex2噬菌体为载体,应用长距离PCR技术(Long Distance PCR.LD-PCR),构建了人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库。应用SEREX方法进行筛选,对阳性克隆进行临床与生物活性鉴定,试图能找到与CRC密切相关的抗原蛋白、DNA或mRNA,期望能为大肠癌的早斯诊断、生物治疗以及肿瘤疫苗的研究 打下基础。 材料与方法 1.。DNA的合成:术中取新鲜大肠癌组织标本,用Trizol Ls Reagent 试剂提取总RNA,用RT~pcR反转录合成cDNA第1链,用LD一PcR合 成cDNA第2链,第2链。DNA经蛋白酶K消化后,用胡I酶切,经 chroma spin-4oo柱子过柱除去小于500bp的小片段。 2.cDNA与人TriPIExZ噬菌体连接:cDNA与去磷酸化的入TriplExZ噬 菌体左、右臂连接,连接产物进行体外包装反应,再转化E.coll’ XLI一blue 大肠杆菌,构建成cDNA噬菌体表达文库。 3.文库的质量鉴定:指标为滴度、重组率、。DNA片段大小。文库按不 同浓度稀释,转化E.coli XLI一blue大肠杆菌感受态细胞,滴定文库的滴 度,确定文库容量大小。用ITPG诱导和x一gal显色测定重组率。用PCR 方法和动I酶切鉴定文库的重组噬菌体插入的外源cDNA片段大小。 4.SEREX筛选:又称重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术。首先构建 大肠癌cDNA表达文库,然后用大肠癌患者血清进行免疫筛选,进一步 鉴定阳性克隆的特性。 5,大肠癌患者血清预吸收:制备E.coli XLI一Blue大肠杆菌感受态细胞, 制备大肠杆菌E.coli XLI七lue裂解液,对大肠癌患者血清中抗大肠杆菌 E.coli XLI一blue抗体的进行预吸收,以消除筛选中的假阳性结果。 6.SEREX筛选过程:大肠癌cDNA文库铺90~培养皿,准备文库克 隆。见噬斑长出后,用预先20~比正TG溶液浸泡的硝化纤维素膜伽c 膜),42℃诱导4小时转膜,剥膜后进行免疫反应,用大肠癌患者血清作 一抗,用碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体作二抗,以氮蓝四哇困BT) 和5’一澳一4’一氯一3’一叫噪磷酸(B cIP)进行显色反应,深蓝色噬斑为阳性克隆。 7.阳性克隆鉴定:阳性克隆用150~平板扩增,用Qiagen公司的人 一DNA试剂盒提取纯化噬菌体DNA,用PCR鉴定阳性克隆cDNA片段大 小。 8.阳性克隆测序分析:阳性克隆。DNA用Pfu高保真酶做PcR,PcR 产物克隆到pUCm一T载体做T一克隆,进行测序。序列生物信息学分析采 用NeBI的All Ge妞B越水+EMBL+DDBJ+P DB sequences DateLbase进行 BLAST基因比对分析。 3 9.阳性克隆m丑NA表达:根据cDNA序列设计合成引物,以G3PDH为 内对照,用RT~PCR方法检测SEREX筛选获得的有意义的阳性克隆,如 干扰素诱导的跨膜蛋白一1样基因(INF一rrMP)mRNA在大肠癌、胃癌、食 管癌和肝癌组织中的表达。 1 0.阳性克隆蛋白表达:将干扰素诱导的跨膜蛋白一1样(INF一ITMP)cDNA 克隆到pET.Trx表达载体,重组表达载体转化BLZI(D E3)plysS大肠杆菌 表达融合蛋白。 n.患者血清相应抗体检测:用Westem blot方法,以重组pET.Trx表达 载体转化BL21(D E3)P lyss大肠杆菌表达融合蛋白为抗原,检测患者血清 中的抗干扰素诱导的跨膜蛋白一1抗体,以辣根过氧化物酶标记的(HRp conjugated)山羊抗人IgG作二抗,检测大肠癌、胃癌、食管癌、肝癌患 者血清中出现相应抗体的频率。 结果 1.文库构建:成功构建成3个大肠癌cDNA噬菌体表达文库,滴度分 别为2.39xlo乍n刀nd、2.o7Xlo乍丘功叮l、l.s6Xlo6pfi刀ml。重组率分别为 97.5%、94.5%、96.5%。文库扩增后滴度分别为3.gxlo‘opfi刀ml
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R735.3

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张必成,李忠花,朱诗国,曹利,余鹰,李伟芳,李桂源*;鼻咽癌上皮细胞株HNE1 cDNA文库的构建及鼻咽癌表达上调基因的筛选[J];癌症;2002年02期
2 黄宝成,陈志南,徐力青,姜绍谆;人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定[J];第四军医大学学报;2000年02期
3 南清振,高蕾,杨希山,肖冰,周京旭,张亚历,施理;mRNA差异显示法筛选大肠癌相关基因[J];第一军医大学学报;2001年04期
4 罗晓勇,王晓怀,杨太成,江悦华,周殿元;人胃癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定[J];河南肿瘤学杂志;1998年06期
5 殷智榕,张云汉,陈东,高冬玲,姜国忠,郝志芳;食管癌消减cDNA文库的构建[J];河南医科大学学报;2001年05期
6 杨秋林,陆惠民,邬敏辰,黄伟达;弓形虫RH株速殖子期表达型cDNA文库的构建及鉴定[J];寄生虫与医学昆虫学报;2001年02期
7 吴岚军,毛秉智,王升启;人胃癌抑制消减cDNA文库的构建及文库质量分析[J];军事医学科学院院刊;2001年01期
8 杨工,郑树;大肠癌的流行特征[J];临床外科杂志;1994年02期
9 王文亮,杨帆,张晓东,马运国,王冰枫;肝癌凋亡细胞cDNA文库构建及其凋亡相关基因的初步筛选[J];临床与实验病理学杂志;1999年06期
10 巫振洪,吕凤林,吴玉章;重组cDNA表达文库血清学分析技术筛选肿瘤抗原的研究进展[J];免疫学杂志;2002年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 谢永芳,舒坤贤,梁亦龙,袁帅,张继承;小鼠胚胎发育中期肠细胞增殖与凋亡的研究[J];癌变.畸变.突变;2005年01期
2 王子良,许丽艳,李恩民;质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响[J];癌变.畸变.突变;2005年02期
3 康振桥;季艳霞;杨志勇;苏光;崔彦芝;;血管内皮生长因子亚型在人乳腺癌细胞中的表达差异[J];癌变.畸变.突变;2006年03期
4 安刚;黄天华;谢庆东;王德刚;;pCXN2-mIZUMO对C57BL/6小鼠生育能力的影响[J];癌变.畸变.突变;2007年04期
5 朱斌;杨罗艳;赵晓昆;;膀胱癌多药耐药基因MDR-1与金属硫蛋白-3表达的关系[J];癌变.畸变.突变;2007年05期
6 毕玉平,廖俊杰,单雷,王兴军,徐平丽;番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究[J];山东农业科学;1997年06期
7 单雷,毕玉平,王兴军,徐平丽,李广存;双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析[J];山东农业科学;1998年04期
8 葛宏华,孙莉宁,张其瑞;家蚕血淋巴蛋白的发育变化和BmLSP的纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);2001年03期
9 王北艳;曹宁;汤晖;;苜蓿中华根瘤菌电转条件的优化[J];安徽农学通报;2008年11期
10 刘可杰,吕淑霞,沈世华;FaDREB1基因RNAi的植物表达载体的构建[J];安徽农业科学;2005年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王春花;成军;郎振为;吴煜;杨艳杰;张黎颖;刘妍;;基因表达谱芯片技术筛选XTP3蛋白反式调节基因[A];第一届全国人工肝及血液净化学术年会暨全国人工肝及血液净化攻关协作组成立大会论文集[C];2004年
2 唐南洪;王晓茜;李秀金;陈燕凌;;构建特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因(hGS)的肝细胞[A];第三届全国重型肝病及人工肝血液净化学术年会论文集(上册)[C];2007年
3 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
4 商庆龙;谷鸿喜;;HPV16 L1蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性研究[A];庆祝黑龙江省免疫学会成立十周年(1993—2003)论文集[C];2003年
5 陈振文;赵太云;孙贺娟;路静;王迎;孟霞;曹争和;王钜;;微卫星DNA与生化标记分析对长爪沙鼠群体遗传分析的比较[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年
6 王革;王妍;何凌冰;乔刚;朱一松;王君艳;;酵母分泌表达重组人神经生长因子[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年
7 吴翰桂;郑树;;原位杂交和原;位RT-PCR技术检测肿瘤相关新基因SNC66在肝脏及肝癌组织中的表达[A];动物学专辑——上海市动物学会2000年年会论文集[C];2000年
8 任华;顾建华;孙竹筠;沈万赟;吴鹰;周忠良;;RT-PCR法检测斑马鱼(Danio rerio)卵黄蛋白原mRNA表达[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
9 马珺;陈云霜;王爱善;李仲逵;;珍稀鸟类东方鹳的性别鉴定[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
10 马勋;陆承平;;猪戊型肝炎病毒新疆分离株全基因序列的分析[A];中国科协2005年学术年会“新疆现代农业论坛”论文专集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 魏朝明;中国螽(虫斯)总科昆虫的RAPD分析研究[D];陕西师范大学;2000年
2 贾永清;表达禽流感病毒HA基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D];东北农业大学;2000年
3 姜永厚;新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究[D];东北农业大学;2000年
4 崔俊;c-fms癌基因异常激活机制及携带AFP增强子反义c-fms与肝癌的研究[D];第一军医大学;2000年
5 陈烨;幽门螺杆菌粘附素HpaA的克隆、表达及其免疫原性和保护性研究[D];第一军医大学;2000年
6 刘明;H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究[D];中国农业科学院;2000年
7 姚乌兰;多粘类芽孢杆菌WY110抗菌蛋白的制备及其基因克隆和表达[D];中国农业科学院;2000年
8 叶纨芝;白菜细胞核雄性不育相关基因mf-CYP450的分子鉴定、克隆和序列分析[D];浙江大学;2001年
9 邵吉民;大肠癌相关基因ST13/SNC6表达的蛋白质研究[D];浙江大学;2001年
10 吴健;肝移植病人乙型肝炎病毒再感染的临床和基础研究[D];浙江大学;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李刚;中国美利奴绵羊MHC Class Ⅰ区段429P24BAC克隆序列组成与结构分析[D];石河子大学;2010年
2 肖飞;肝癌相关抗原GCF2基因同源片段的原核表达及鉴定[D];广西医科大学;2011年
3 陈尧磊;52例青年大肠癌临床特征分析[D];中南大学;2011年
4 白大章;中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区段349Ⅰ12 BAC克隆基因组成与结构分析[D];石河子大学;2011年
5 姜韬;青年人大肠癌临床病理学分析[D];宁夏医科大学;2010年
6 苑丽娜;植物病原卵菌RXLR效应蛋白Avr1b互作蛋白的初步筛选[D];西北农林科技大学;2011年
7 李泓澜;肥胖与女性结直肠癌关系的前瞻性队列研究[D];复旦大学;2010年
8 刘波;稻蝗及其近缘属部分种RAPD多态性及中华稻蝗种群遗传多态性研究[D];陕西师范大学;2000年
9 郭巍;苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因克隆及表达的研究[D];东北农业大学;2000年
10 刘怀然;鸡传统性法氏囊病抗独特型抗体疫苗的研究[D];东北农业大学;2000年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郭俊明,何小洪,廖异平,罗超权;全反式维甲酸和1,25-二羟维生素D_3联合应用对大肠癌细胞的分化诱导作用[J];癌症;1999年06期
2 李忠花,曹利,向娟娟,张必成,向秋,唐珂,周鸣,李小玲,李伟芳,李桂源;鼻咽癌细胞中表达上调的新基因NAG23(FBXO30)的克隆与分析[J];癌症;2001年09期
3 杨秋林,陆惠民,邬敏辰,黄伟达;弓形虫RH株速殖子期表达型cDNA文库的构建及鉴定[J];寄生虫与医学昆虫学报;2001年02期
4 张晓东,王文亮;阿霉素诱导人肝癌细胞株HCC-9204肝癌细胞凋亡的形态学观察[J];临床与实验病理学杂志;1996年03期
5 唐艳,倪兵,吴玉章;人黑色素瘤抗原MAGE-3基因的克隆与表达[J];免疫学杂志;2001年06期
6 余鹰谢,奕曹利,张必成,周鸣,李桂源,public.cs.hn.cn;一个新鼻咽癌抑瘤候选基因的克隆及其功能初步分析[J];生物化学与生物物理进展;2000年03期
7 覃文新,万大方,赵新泰,蒋惠秋,顾健人;噬菌体DNA的快速抽提[J];生物化学与生物物理进展;1998年02期
8 余鹰,张必成,谢奕,曹利,周鸣,湛凤凰,李桂源;鼻咽癌中差异表达基因的分析和克隆[J];生物化学与生物物理学报;2000年04期
9 覃文新,顾健人;人类恶性肿瘤中染色体17p13.3区带的杂合性丢失[J];生命科学;1999年02期
10 杨伟廉,王尧,韦永新,阮长耿,杜子威;抗胶质瘤细胞单克隆抗体SZ-38及其识别抗原的生化特征[J];生物化学杂志;1988年06期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 钟世顺,张振书,邓海军,李恕军,李淑梅;大肠癌组织中血管内皮生长因子的表达及其临床意义[J];实用癌症杂志;2001年04期
2 范应方,聂晶;血管内皮生长因子与大肠癌的关系[J];实用癌症杂志;2001年05期
3 盛剑秋,李世荣,晨智敏,高革;肠镜下大肠癌组织激光诱发自体荧光光谱特征[J];中国激光医学杂志;2001年03期
4 黄小荣;浙北地区大肠癌若干流行病学特点[J];中国内镜杂志;2001年01期
5 韩明勇,郭其森,王兴武,贾慧;大肠癌血管内皮生长因子和新生血管的临床意义研究[J];山东医药;2004年22期
6 成延萍,陈晓荣,惠起源,魏晓丽,张晓华;血管内皮生长因子在大肠癌中的表达及意义[J];陕西医学杂志;2004年09期
7 陈素钻,俞晶,李映华,荆绪斌,郭光华;青年女性大肠癌的临床特点分析[J];中国基层医药;2005年08期
8 李秋元;俞晶;郑忠生;陈素钻;;青年大肠癌92例发病与病理特点分析[J];河北医学;2006年05期
9 米丽娜;关景明;吕丽艳;;抗细胞凋亡基因及其与大肠癌关系的研究进展[J];世界华人消化杂志;2006年33期
10 吕丽艳;关景明;米丽娜;;细胞间隙连接通讯及其通路蛋白与大肠癌发生关系的研究进展[J];世界华人消化杂志;2006年36期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郭善禹;杜宽航;卜文;;细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在大肠癌中的表达意义[A];2001'全国肿瘤外科学术会议论文汇编[C];2001年
2 郑树;;我国大肠癌易感人群研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
3 肖冰;王媛媛;张亚历;;大肠癌干细胞作用相关基因及信号通路的筛选鉴定[A];第二十三届全国中西医结合消化系统疾病学术会议暨消化疾病诊治进展学习班论文汇编[C];2011年
4 崔焌辉;陈栋;杨振宇;;细胞粘附分子在大肠癌组织中表达及其临床意义[A];第十一次全国中西医结合大肠肛门病学术会议论文汇编[C];2006年
5 郑树;蔡心涵;曹江;耿礼义;郑雷;张颜明;施正政;;人新的大肠癌负相关基因的研究[A];第六次全国大肠癌会议暨中日韩大肠癌会议论文汇编[C];1998年
6 耿敬姝;王艳颖;冯占军;赵玉兰;赵家宏;;大肠癌细胞增殖与P~(16)表达关系的研究[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年
7 雷雯;周锡庚;郁宝铭;陈晓耕;王清水;;血管内皮生长因子和血管生成与大肠癌发展的关系[A];2001'全国肿瘤外科学术会议论文汇编[C];2001年
8 丁杰;;血管内皮细胞生长因子与大肠癌治疗[A];2007年贵州省医学会外科分会学术年会论文汇编[C];2007年
9 申洪;;大肠癌组织结构的体视学诊断参数研究[A];首届粤港生物物理学术研讨会论文集[C];1999年
10 许红民;王强;白雪娟;钟定荣;曹秀堂;张金萍;丁彦青;姚开泰;;大肠癌差异表达基因的筛查[A];中华医学会病理学分会2005年学术年会论文汇编[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前8条
1 记者 施嘉奇;抽点血,找出大肠癌早期线索[N];文汇报;2010年
2 记者 衣晓峰 靳万庆 通讯员 李晓丽;大肠癌多药耐药判断标准有新“尺度”[N];中国中医药报;2003年
3 何苗苗 蒋卓勤;饮食相关成分在大肠癌发生中的作用[N];中国中医药报;2003年
4 通讯员 方序 周炜 记者 宦建新;科学家发现大肠癌靶向细胞[N];科技日报;2014年
5 记者 张灿灿 特约记者 陆桂芳 通讯员 方序;加剧大肠癌进展关键细胞现形[N];健康报;2014年
6 记者 张乐;一种细胞会导致大肠癌肿瘤恶化[N];新华每日电讯;2014年
7 衣晓峰 李晓丽;肠癌多药耐药判断有新说[N];健康报;2003年
8 ;阿司匹林新用途[N];中国高新技术产业导报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 邱云平;基于色谱质谱联用技术的大肠癌代谢组学研究[D];上海交通大学;2008年
2 冯晓莹;胰岛素样生长因子系统在大肠癌的表达及意义研究[D];大连医科大学;2007年
3 马怡茗;大肠癌发生发展及转移相关分子的筛选和生物学功能研究[D];中国协和医科大学;2010年
4 陈远光;人大肠癌组织蛋白质组二维凝胶电泳技术的建立及应用[D];中南大学;2003年
5 毕新宇;大肠癌病理学特征与预后的关系及硒蛋白-P在大肠癌组织中表达及其临床意义[D];中国协和医科大学;2004年
6 王媛媛;大肠癌干细胞基因表达谱特点及其信号通路的筛选鉴定[D];南方医科大学;2011年
7 许红民;不同分化程度大肠癌的基因表达谱分析[D];第一军医大学;2004年
8 汤思哲;大肠癌组织细胞凋亡相关蛋白的研究[D];天津医科大学;2004年
9 龚磊;反义RNA技术下调多胺代谢关键酶抑制大肠癌细胞增殖及分子机理研究[D];山东大学;2007年
10 程变巧;Galectin-3在大肠癌细胞系中表达及其增殖信号通路研究[D];南方医科大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王洪宇;青年大肠癌的临床特点及生存分析[D];吉林大学;2010年
2 尹东;血清层粘连蛋白在大肠癌中的检测及临床应用[D];新疆医科大学;2001年
3 瞿金妙;大肠癌预后的多因素COX模型分析[D];浙江大学;2002年
4 张波;5-氨基乙酰丙酸诱导原卟啉Ⅸ定量检测及大肠癌荧光光谱研究[D];中南大学;2004年
5 倪然;人工神经网络联合肿瘤标志对肺癌和大肠癌的预警[D];郑州大学;2009年
6 李欣;具有家族背景大肠癌微卫星不稳定性研究[D];中国医科大学;2005年
7 瞿发林;线粒体DNA拷贝数与大肠癌发病风险及预后的关联分析[D];第四军医大学;2011年
8 吴斌;核因子-κB在大肠癌组织中的表达及意义[D];重庆医科大学;2003年
9 王志鹏;芪连扶正胶囊联合化疗治疗大肠癌的临床研究[D];山东中医药大学;2010年
10 周帆;基于第二代高通量测序技术中国大肠癌病例大肠癌相关基因单核苷酸多态性分析[D];浙江大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026