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人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库的构建及大肠癌相关抗原的SEREX筛选

刘宇虎  
【摘要】: 背景、目的 大肠癌(colorectal cancer.CRC)是消化系统常见恶性肿瘤之一,发病率居全球最常见恶性肿瘤的第4位,是我国位居第4位的常见恶性肿瘤。20世纪90年代起,其发病率和死亡率呈逐年增高的趋势,发病年龄也趋于年轻化,在我国占癌症死亡的第5位。大规模的人群普查研究表明,35岁以上的人群中,大肠癌的发病率约为24~32例/10万人口。随着分子生物学、遗传学和生物技术的发展,近几年来我国在大肠癌的基础、临床和预防方面的研究取得了较大的进展。然而迄今对其发病、复发、转移机制的了解仍然十分缺乏。大肠癌的治疗是以手术为主的综合治疗,根治术后的化疗是大肠癌综合治疗的一个重要组成部分。对高危人群(年龄在40以上、有大肠癌家族史或肠息肉患者)进行普查能早期发现大肠癌,但大肠癌病变小时对身体的影响不大,临床无明显表现,CEA特异性又不高,结肠镜检查目前尚未普及,目前大肠癌的早期诊断还缺乏简易有效手段。寻找大肠癌的肿瘤标志物与特异抗原或相关抗原就显得十分重要,以能早期发现大肠癌,使患者早期接受手术治疗,以提高5年生存率。 cDNA文库的应用,为鉴定肿瘤抗原基因奠定了基础,近年发展的鉴定肿瘤抗原的血清学方法—重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术SEREX(serological identification of antigen by recombinant cDNA expression libraries),较直接地鉴定了肿瘤抗原。研究表明,通过构建cDNA文库,进一步筛选,是发现新的肿瘤标志物的有效途径。我们选取大肠癌患者的新鲜癌组织作为建库材料,以λTrip1Ex2噬菌体为载体,应用长距离PCR技术(Long Distance PCR.LD-PCR),构建了人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库。应用SEREX方法进行筛选,对阳性克隆进行临床与生物活性鉴定,试图能找到与CRC密切相关的抗原蛋白、DNA或mRNA,期望能为大肠癌的早斯诊断、生物治疗以及肿瘤疫苗的研究 打下基础。 材料与方法 1.。DNA的合成:术中取新鲜大肠癌组织标本,用Trizol Ls Reagent 试剂提取总RNA,用RT~pcR反转录合成cDNA第1链,用LD一PcR合 成cDNA第2链,第2链。DNA经蛋白酶K消化后,用胡I酶切,经 chroma spin-4oo柱子过柱除去小于500bp的小片段。 2.cDNA与人TriPIExZ噬菌体连接:cDNA与去磷酸化的入TriplExZ噬 菌体左、右臂连接,连接产物进行体外包装反应,再转化E.coll’ XLI一blue 大肠杆菌,构建成cDNA噬菌体表达文库。 3.文库的质量鉴定:指标为滴度、重组率、。DNA片段大小。文库按不 同浓度稀释,转化E.coli XLI一blue大肠杆菌感受态细胞,滴定文库的滴 度,确定文库容量大小。用ITPG诱导和x一gal显色测定重组率。用PCR 方法和动I酶切鉴定文库的重组噬菌体插入的外源cDNA片段大小。 4.SEREX筛选:又称重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术。首先构建 大肠癌cDNA表达文库,然后用大肠癌患者血清进行免疫筛选,进一步 鉴定阳性克隆的特性。 5,大肠癌患者血清预吸收:制备E.coli XLI一Blue大肠杆菌感受态细胞, 制备大肠杆菌E.coli XLI七lue裂解液,对大肠癌患者血清中抗大肠杆菌 E.coli XLI一blue抗体的进行预吸收,以消除筛选中的假阳性结果。 6.SEREX筛选过程:大肠癌cDNA文库铺90~培养皿,准备文库克 隆。见噬斑长出后,用预先20~比正TG溶液浸泡的硝化纤维素膜伽c 膜),42℃诱导4小时转膜,剥膜后进行免疫反应,用大肠癌患者血清作 一抗,用碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体作二抗,以氮蓝四哇困BT) 和5’一澳一4’一氯一3’一叫噪磷酸(B cIP)进行显色反应,深蓝色噬斑为阳性克隆。 7.阳性克隆鉴定:阳性克隆用150~平板扩增,用Qiagen公司的人 一DNA试剂盒提取纯化噬菌体DNA,用PCR鉴定阳性克隆cDNA片段大 小。 8.阳性克隆测序分析:阳性克隆。DNA用Pfu高保真酶做PcR,PcR 产物克隆到pUCm一T载体做T一克隆,进行测序。序列生物信息学分析采 用NeBI的All Ge妞B越水+EMBL+DDBJ+P DB sequences DateLbase进行 BLAST基因比对分析。 3 9.阳性克隆m丑NA表达:根据cDNA序列设计合成引物,以G3PDH为 内对照,用RT~PCR方法检测SEREX筛选获得的有意义的阳性克隆,如 干扰素诱导的跨膜蛋白一1样基因(INF一rrMP)mRNA在大肠癌、胃癌、食 管癌和肝癌组织中的表达。 1 0.阳性克隆蛋白表达:将干扰素诱导的跨膜蛋白一1样(INF一ITMP)cDNA 克隆到pET.Trx表达载体,重组表达载体转化BLZI(D E3)plysS大肠杆菌 表达融合蛋白。 n.患者血清相应抗体检测:用Westem blot方法,以重组pET.Trx表达 载体转化BL21(D E3)P lyss大肠杆菌表达融合蛋白为抗原,检测患者血清 中的抗干扰素诱导的跨膜蛋白一1抗体,以辣根过氧化物酶标记的(HRp conjugated)山羊抗人IgG作二抗,检测大肠癌、胃癌、食管癌、肝癌患 者血清中出现相应抗体的频率。 结果 1.文库构建:成功构建成3个大肠癌cDNA噬菌体表达文库,滴度分 别为2.39xlo乍n刀nd、2.o7Xlo乍丘功叮l、l.s6Xlo6pfi刀ml。重组率分别为 97.5%、94.5%、96.5%。文库扩增后滴度分别为3.gxlo‘opfi刀ml


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