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《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
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人骨髓基质干细胞克隆的培养及其造血支持作用的实验研究

林竞韧  
【摘要】: 研究背景/目的:骨髓基质干细胞是骨髓中除造血干细胞和内皮祖细胞以外的另一种成体干细胞,具有广泛的分化潜能和造血支持作用,是组织工程和基因治疗最有应用潜能的候选细胞之一。目前认为MSC是一异质性的细胞群,已证实至少存在3种形态的细胞,但由于无特征性的表面标记其分离纯化缺乏特异性,它的生物学特性如诱导分化的机理及最终的分化潜能等仍不甚了解,同时其体外培养方法也有待完善。近年来基质干细胞与造血干细胞共同移植加快造血恢复作用及降低GVHD的作用日益受到重视。克隆培养是进一步研究其生物特性的有效方法。本实验拟探讨骨髓基质干细胞克隆的培养方法和研究其对体内外造血支持作用的影响。为骨髓基质干细胞体外大量扩增培养及造血干细胞与基质干细胞共同移植做初步尝试。 方法:1.人骨髓基质干细胞的克隆培养及生物学特性的检测 以密度梯度离心法和贴壁法分离人骨髓基质干细胞,以套圈法获取克隆源骨髓基质干细胞扩增培养。检测其生物学特性,包括①MSCs的表面标记检测;②MSCs的生长曲线测定,分别检测了P5、P10、P17代MSCs;③克隆形成能力的检测,分别检测了P2、P7、P17代细胞;④MSCs的冻存和复苏;⑤原子力显微镜的观察;⑥MSCs转染GFP的实验及⑦MSCs向脂肪细胞和神经元样细胞的定向诱导分化等实验。 2.克隆源人骨髓基质干细胞对脐血造血细胞体外增殖的影响 人骨髓基质干细胞的预处理,传代后接近融合生长的MSCs经15Gy~(60)CO照射。 免疫磁株分离系统正性分离CD34细胞。流式细胞仪检测CD34细胞纯度。 hMSCs对脐血CD34+细胞体外扩增的影响:将分选的脐血CD34+细胞置于不同条件体系培养,包括细胞因子组、细胞因子组+基质干细胞组、基质干细胞组等3组,共培养3周。镜下观察细胞增殖情况,分别计数不同培养时间细胞总数扩增的倍数。比较不同培养阶段(P5和P15)MSCs对造血细胞体外扩增作用的差异。 hMSCs对扩增的CD34+细胞集落形成(CFCs)影响的实验:上述3种体系培养2周的CD34+细胞以2×10~4/孔密度接种到含CFU-MIX培养体 系中,培养21天。分别计数CFU~GM、CFU一、CFU~GE]迈M、BFtl一E 集落数。比较不同培养条件对脐血CFcs扩增的影响。 3.克隆源骨髓基质干细胞对脐血在裸鼠体内造血支持作用的研究 克隆源人骨髓基质干细胞的培养方法同上。 制备脐血单个核细胞。移植脐血单个核细胞和或骨髓基质干细胞给亚致 死剂量60Co照射的裸鼠,移植后观察小鼠精神、饮食、生长、大便、死 亡等一般情况,计数移植后2周、4周和6周外周血及骨髓单个核细胞 数并检测移植后裸鼠骨髓CFU一ML狡集落形成能力。检测其骨髓中CD34 +、CD45+细胞判断脐血造血干细胞的植入情况。进行了急性GVHD 的初步观察,取裸鼠的肝、脾、小肠、肺、皮肤、脑等组织,常规病理 切片,镜检各组织的炎症反应,比较脐血MNCs单独或与MSCs共同移 植移植及不同剂量骨髓基质干细胞移植条件对造血恢复和急性GVHD的 的影响。 结果:本实验所用培养方法能有效扩增克隆来源的骨髓基质干细胞,细 胞倍增时间约为48~72h。能传代20代,使扩增的细胞总数达到1~3 x 1010数量级。流式细胞仪检测示细胞表达CD13、cD29、cD59而不表 达CD 11、CD 14、CD31、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86、CDll7, 表明它是基质干细胞而不是造血细胞。细胞的表面标记显示扩增的是骨 髓基质干细胞且纯度达97%以上,可视为克隆来源的骨髓基质干细胞。 生长曲线示培养的细胞17代以前生长良好,17代以后细胞生长明显变 慢,光镜下形态变大、形状变为不规则,胞浆内及培养液中可见较多颗 粒,折光性差。克隆形成能力检测示MSCs随代次不同而各异,随传代 次数增加,克隆形成能力逐渐降低。常规冻存方法能有效保存细胞,复 苏后活细胞达%%以上,细胞生长传代良好。原子力显微镜观测示典型 细胞为梭形,微观检测示表面有较多角状、颗粒状和不规则突起。基因 转染试验示GFP基因能导入MSCs,约于转染后14天出现绿色萦光, 随时间的推移强度逐渐增强,约于转染后23天达峰值,细胞转染率达 16%。体外诱导分化能力检测显示培养的细胞保持其分化潜能,可分化 成神经元样细胞和脂肪细胞。诱导比例分别为53.3%和60%。 人骨髓基质干细胞对脐血细胞总数扩增能力的影响:不同培养条件下脐 血细胞扩增的总数显示各组在相同培养时间点上存在显著性差异(P 一5- 0.05)。基质干细胞+细胞因子组和细胞因子组都能有效扩增脐血CD34+ 细胞,细胞因子组扩增细胞的能力最强,而单独基质细胞组对造血细胞 体外扩增能力相对较弱。以P15基质干细胞作为支持层细胞时,在培养 的第7、14、21天各组脐血细胞扩增的倍数差异也存在显著性差异。同 以PS代为支持层相比其对脐血细胞的扩增能力明显下降(P0.01)。 MSCs对脐血CD34+细胞CFCs形成能力的影响:将上述MSCs(PS)细 胞+细胞因子组、单纯细胞因子组、单纯基质干细胞组条件下扩增2周的 脐血单个核细胞接种到CFU一Mix培养基中检测其对脐血CFCs扩增的影
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R55

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【参考文献】
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6 林湘艳;高龄孕妇最好做个脐血检查[N];大众卫生报;2009年
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