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半乳糖受体介导的MAP30对乙型肝炎病毒抑制作用的实验研究

王九平  
【摘要】: 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种严重危害人类健康的传染病。乙型肝炎治疗的关键是清除HBV,虽然近年多种抗病毒药物已在临床上用于抑制感染治疗,但治疗效果均不够理想,其原因一是药物本身的抗HBV作用有限;二是药物进入体内后容易扩散,导致在不同组织中相对平均分布,未能在肝脏中形成有效的药物浓度。因此,寻找新的抗病毒药物及给药途径,以进一步提高抗HBV效果实属必要。 乙型肝炎病毒是嗜肝双链DNA病毒,病毒外膜与肝细胞膜融合进入细胞内,病毒基因组的复制过程需要经过共价闭合环状DNA(covalently close circular DNA, cccDNA)转录为前基因组RNA和若干种mRNA、前基因组RNA反转录为负链DNA、以负链DNA为模板复制正链DNA、双链DNA转变为成熟cccDNA等几个生物合成阶段。由前基因组RNA转换为双链环状DNA的过程中,需要一系列同功拓扑酶、DNA聚合酶(DNAp)进行复杂的反应。部分HBV DNA可在DNA整合酶作用下,整合到宿主靶细胞基因组中。 MAP30(momordica anti-HIV protein of 30kD,MAP30)是从葫芦科 萦一门阵医大学俘士学位今仑文 植物苦瓜种子中纯化的一种单链核糖体失活蛋白。国外实验研究表明, MAP30对HIV及疙疹病毒等都具有较明显的抑制作用。MAP30抗HW 病毒的机制是:(1) MAP30进入HIV感染细胞后,非特异性地使核糖体 失活,不能合成病毒复制所需要的酶及蛋白质,而干扰病毒复制。因此 MAP3O抗病毒作用不是HIV特异的。(2)直接作用于病毒DNA、RNA, 使超螺旋DNA变成缺口环状或线状DNA,并使之拓扑失活,而丧失复 制、转录的功能。(3)抑制HIV整合酶的活性。 已知HBV和HIV基因组的复制有相同之处,都有逆转录复制阶段。 王临旭等实验研究发现,MAP30对2.2.巧细胞分泌HBsAg、HBeAg及 细胞内外HBV DNA均有明显的抑制作用,表明MAP3O在体外具有抗 HBV的作用。基于上述理论和实验研究结果,本课题根据肝实质细胞膜 上存在有能专一识别和结合半乳糖基的特异性无唾液酸蛋白受体 (asialoglycoprotein reeeptor,ASGp一R)这一特性,设想通过制备了 Gal一ABH一MAP3o交联物,将MAP30特异性地导入肝细胞,并进一步深 入研究其体内外抗HBV的活性。 首先采用光化学法,以双功能的交联剂ABH(p一azidob~yl hydrazide,交联剂)为桥梁,依次将半乳糖(galactose,Gal)和MAP30交 联,构建了Gal一ABH一MAP30交联物,经紫外扫描对照鉴定,证明 Gal一ABH一 MAP30中MAP30与Gal一ABH是化学偶联。交联率达86.2%。 用氯胺T法将’z5l标记MAP30及Gal一ABH一MAP30,放射性示踪 观察’251一Gal一ABH一MAP30/l气一MAP30在小鼠体内的生物分布特性,显示 ,2,I一Gal一ABH一MAP30的肝浓聚水平及速度远远大于’251一MAP3o,’2、 一Gal一ABH一MAP3o在血液中的分布远小于’251一MAP3o,且具有肝靶向药 物在血液中的再分布特点。体内竞争结合试验显示,事先注射非放射性 Gal一ABH组,肝摄取1251一Gal一ABH一MAP30数量减少,速度延缓,肾脏 排泄增强,表明肝细胞摄取Gal一ABH一MAP30具有特异性。 一4一 第一门阵医口悦学巾件d匕学位金仑文 将Gal一ABH一MAP30及MAP3o,分别加入2.2.15细胞培养液,结果 表明,Gal一ABH一MAp30及MAp30对2.2.15细胞HBeAg的表达及HBV DNA合成均有抑制作用,其中Gal一ABH一MAP30作用强,发生最大效应 的时间也较早。相同剂量的Gal一ABH一MAP30对HBeAg及HBv DNA抑 制效应明显高于MAp3o(p0.05):0.1 pg/ml的Gal一ABH一MAP3o与1.0 pg/ml MAP30具有相似的HBeAg和HBv DNA表达抑制率,提示相当 于MAP30 1/10剂量的Gal一ABH一MAP30既能发挥相似的抗病毒效应; 免疫组化、激光共聚焦及原位杂交实验亦证实了上述结果。 将半乳糖介导的药物用于ayw亚型HBV转基因小鼠,发现 Gal一ABH一MAP3O交联物及MAP30均能抑制血清及肝组织HBV基因的 表达,且Gal一ABH一MAP3O交联物的作用优于MAP3O的作用。 以上实验研究表明,Gal一ABH一MAP30体内外应用具有较好的肝细 胞/肝脏靶向性,与半乳糖交联可以明显提高MAP30的抗HBV效应,是 具有一定应用前景的病毒性乙型肝炎肝靶向治疗的药物。


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