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《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
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霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄果实中特异性表达的研究

江晓玲  
【摘要】: 霍乱是由霍乱弧菌引起的一种急性肠道传染病,由于发病急、传播快、波及面广、危害极为严重,因此其预防和控制受到各国政府的高度重视。在一些经济欠发达、卫生条件较差的地区,预防接种是进行霍乱防治较为有效的措施,但现有疫苗费用昂贵,贮存、运输相当困难,因此,研制成本低、使用简单、易于贮存运输的新疫苗是当前疫苗研究的一大热点。 植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。转基因植物产生的疫苗,可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织,通过刺激机体粘膜的特异性免疫应答,使人体获得较持久的疾病防御能力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便,因此,“植物口服疫苗”得到了世界卫生组织(WHO)的提倡,开展这方面的研究对推动全球免疫计划的实施具有重要的意义。 本研究利用植物DNA重组技术,培育出只在番茄果实中特异、高效表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物口服疫苗,为霍乱弧菌植物口服疫苗的应用研究及市场化提供实验基础。 首先,我们通过酶切、PCR等方法分别获取目的基因CTB和番茄果实特异性启动子——E8启动子基因片段,利用质粒pBlueScript(+)SK、T载体和PBI121上的酶切位点,构建启动子为E8的植物双元表达载体Pe8-CTB,以冻融法将其转至根癌农杆菌LBA4404中。 再通过正交设计实验,以番茄子叶为外植体,对所选用的番茄品种、子叶苗龄、植物激素浓度和培养温度等条件进行优化,结果表明,当选用穗丰品种、培养温度为27±1℃、BA=3.0 mg/L、IAA=0.1mg/L 球少尹禅论丈 时,芽的再生频率平均高达98.5%,每片子叶外植体的平均再生芽数达 6.8个。 在高效再生系统的基础上,优化农杆菌稀释浓度、浸染时间和转化 方式等条件。在子叶预培养2d、活化农杆菌稀释倍数约30倍、侵染时 间为10min的情况下,子叶存活时间最长,抗性芽产生频率达25%。在 此条件下,将CTB基因通过农杆菌浸染法对番茄细胞进行转化,筛选到 30株抗性番茄幼芽。对这些抗性芽作伸长、生根诱导培养,其中26株 长成番茄植株并开花结果。 对植物基因组DNA的PCR、dot blot和Southern印迹杂交,证实 所获得的26株抗性植株中14株有CTB整合到番茄基因组DNA中。 提取转基因番茄植株不同部位组织、不同时期果实总的可溶性蛋 白,进行ELISA检测和Western b10t杂交,结果表明其中2株的番茄 果实有CTB的表达,表达量随着果实的成熟而升高,并在完全成熟果实 中达到最高(455ng/g鲜重和385ng/g鲜重),达到了当前国际上所报 道的外源基因在番茄中表达的较高水平。 动物喂饲实验研究正在进行中。
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R516.5

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