体外构建具有理想方向性组织工程化大鼠骨骼肌纤维的实验研究

【摘要】： 研究背景：目前，对由各种原因所致骨骼肌缺损多采用肌瓣或者肌皮瓣移植治疗。临床效果虽然理想，但是由于此种治疗不可避免的将带来供区新的缺损，故科学家们一直在不懈努力以寻求新的治疗手段。随着组织工程学的飞速发展，越来越多的人们致力于组织工程化骨骼肌的构建，希望借此解决上述难题。 本课题的宗旨，是寻求一种可行的方法，以体外构建具有良好方向性的组织工程化大鼠骨骼肌纤维，为最终构建适宜临床应用的组织工程化骨骼肌打下坚实基础。 第一部份：离心作用检测细胞与材料间黏附力及其初步应用 目的：介绍一种简单易行的检测细胞与材料间黏附力的方法。 方法：本方法的建立基于离心力在转速一定时与半径成正比的原理。医用石膏制备培养皿固定装置，于培养皿底制备材料薄膜(包括有PLGA,PLGA+COL I,PLGA+COL I+FN)，待大鼠骨骼肌卫星细胞悬液与其作用一定时间后，一定转速开动离心机。测定未脱落细胞斑的半径R，取均值。 结果：上述三种材料表面未脱落大鼠骨骼肌卫星细胞圆斑半径(R)分别为7.96mm、15.11mm、26.10mm，三组间有显著性差异(P均小于0.001)。 结论：1) R的变化可反映细胞与材料间粘附力的改变。2)利用离心作用检测细胞与材料间的黏附力是可行的，尤其适用于同一种细胞与不同材料间黏附力的比较。3) COL I和FN的使用可以增加大鼠骨骼肌卫星细胞与PLGA间的黏附。 第一军医大学博士学位论文 第二部分:动态张应变下大鼠骨骼肌卫星细胞的三维培养 目的:探讨借助动态张应变三维培养条件下，体外构建具有良好方 向性组织工程化大鼠骨骼肌纤维的可能性。 方法:聚乙烯醇缩甲醛微孔材料裱衬PLGA为支架材料，复合大鼠 骨骼肌卫星细胞。借助智能化张应变细胞培养系统，对大鼠骨骼肌卫星 细胞一支架材料复合物施加牵张应变(10%应变、频率0.2Hz，每小时加 载10而n，共作用48hr)。扫描电镜观察大鼠骨骼肌卫星细胞形态学变化 以及排列情况，细胞计数以及通过检测磷酸肌酸激酶(CPK)研究动态 张应变对细胞增殖与分化的影响。分别利用半定量Rr.PCR和EUSA技 术从mRNA以及蛋白水平，探讨动态张应变对大鼠骨骼肌卫星细胞功能 蛋白(aiPha一肌动蛋白与肌球蛋白)的影响。 结果:1)在动态张应变的作用下，骨骼肌卫星细胞沿应力方向延伸， 并见到肌小管形成。而未施加应力的骨骼肌卫星细胞在各个方向上都有 突起，未见到肌小管形成。而且动态张应变可以促进细胞增殖与分化(细 胞数增加了14.6%，CPK值增加了32%)(P均小于0.001)。2)在受到 动态张应变刺激后，大鼠骨骼肌卫星细胞aiPha一肌动蛋白对185 RNA的 灰度比值，由0.45升高至0.54;肌球蛋白对185 RNA的灰度比值由1.65 升至2.21。ELISA结果也显示:动态张应变使得骨骼肌aiPha一肌动蛋白 的合成增加了24%，肌球蛋白合成增加了34%。 结论:动态张应变，可以刺激大鼠骨骼肌卫星细胞的增殖分化以及 功能蛋白的表达与合成。而且，动态性张应变有利于肌纤维理想极性的 形成，从而有助于组织工程化骨骼肌的构建。 第三部分:大鼠成肌细胞与具有平行结构支架材料的体外复合培养 目的:探讨借助将支架材料制备成平行状结构，复合大鼠成肌细胞 后，体外构建具有良好方向性组织工程化大鼠骨骼肌肌纤维的可能性。 方法:首先将医用可吸收缝合线平行排列并制备成圆柱状，与大鼠 成肌细胞株L6体外复合培养。借助倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞 的形态学变化以及排列情况。MTT法检测体外培养早期细胞增殖，磷酸 肌酸激酶(CPK)检测细胞分化。 结果:大鼠成肌细胞与由胶原蛋白和甲壳素制备的医用可吸收缝合 线有很好的薪附，细胞沿缝线呈现串珠样，并可以见到细胞聚集现象。 一3- 第一军医大学博士学位抢文 24hr后细胞主要为圆球形，随后细胞迁移、伸展、并可以向各个方向伸 出突起。体外培养第四天，细胞密集于材料表面，并相互融合，沿材料 纵轴排列。并可以见到肌小管形成。与支架材料复合后，细胞增殖迅速， 于第4天达到平台期。第6天细胞增殖下降。但是细胞分化呈现逐渐增 强趋势。 结论:实验结果提示:借助具有平行结构支架材料体外构建具有良好 方向性组织工程化大鼠骨骼肌纤维有一定的可行性。其增殖、分化与骨 骼肌再生过程有一定的吻合。 总结:本实验中，作者首先利用离心力与距转轴间距离成正比原理， 建立一种简单易行的检测细胞与生物材料间钻附力的方法。并基于不同 设计理念，即成肌源性细胞在机械应变下三维培养以及与具有一定方向 性支架材料体外培养，探讨体外构建具有良好方向性组织工程化大鼠骨 骼肌纤维的可行性。结果显示，上述两种方法均有助于体外形成具有良 好方向性的组织工程化大鼠骨骼肌纤维，从而为组织工程化骨骼肌的构 建奠定基础。