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《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
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白细胞介素—6诱导相关新基因的功能研究

夏荣  
【摘要】: 细胞因子是免疫和造血系统中细胞间的信号传递分子。这些因子通过与靶细胞上的特异性受体结合来表达其生物功能。细胞因子作用于受体的一个重要结果是诱导基因表达,细胞膜上的受体接收特定的来自胞外的信号刺激后将这种信号传至胞内,产生一系列新的信号分子和有序的系列化级联反应,最终对细胞乃至整个生物体的生理功能产生影响。白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞因子,对造血干细胞,淋巴细胞,巨核细胞,肝细胞具有促进生长、诱导分化的功能。其作用于敏感细胞时,必将导致一些基因的表达,克隆这些基因,必将有助于进一步阐明IL-6信号转导途径及信号分子的作用机制,同时也将有助于进一步阐明IL-6与某些疾病的相关性。 1.IL-6相关EST的电子克隆,候选新基因的钓取及生物信息学分析 利用Siclone软件包对5个本研究室保存的在Genebank上注册的IL-6作用相关的EST进行了电子克隆,获得了五个全长cDNA序列,依据实验工作号分别命名为E-LX1、E-LX2、E-LX3、E-LX4、E-LX5。利用Goldkey软件对EST及电子克隆(E-clone)结果进行比对分析,明确EST在eclone中的插入部位及其相似率,以判断EST序列是否被有效克隆。同时通过BLAST对这五个全长cDNA的序列进行相似性检索及可读框架(ORF)分析。结果表明4个EST获得了有效延伸。其中LX1和LX3的全长cDNA是具有开放阅读框架的功能未知新基因;而LX2的EST序列在电子克隆延伸所获得的全长cDNA中仅保存了44.61%的一致性,为电子克隆的误判结果或无法延伸,没有研究的意义;LX4为非编码区;LX5可能为内含子。值得注意的是LX3为符合极典型有效翻译特征(Kozak规律)的全长cDNA功能未知基因。进一步信息学分析显示由它编码的308个氨基酸序列中含有ASP富含区和EF_HAND_2结构及多个PKC(蛋白激酶C)磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点,N-十四酰化位点。分析显示它是外周结合蛋白超家族 博士学位论文 中文摘要 激酶磷酸化位点,N一十四酞化位点。分析显示它是外周结合蛋白超家族 的一个新成员,与该家族中的ZGBP最接近,推测其可能具有刺激淋巴 细胞增殖及增加外周血淋一巴细胞内钙的浓度等功能。 通过RT一PCR的方法,我们在国际上首次从IL一6诱导sh的人U937 细胞中成功钓取了功能未知新基因LX3。DNA序列测定表明通过分子生物 学实验钓取的LX3基因与电子克隆所获得的E一Lx3基因相似性达99.68 %。而在同样培养条件但无IL一6诱导及TNF诱导的的U937细胞中没有 钓取到该基因,初步说明我们钓取的Lx3是与IL一6诱导相关的新基因。 2.功能未知新基因LX3的表达特征分析及细胞定位的研究 为进一步研究LX3基因与IL一6作用的相关性,采用半定量RT一PCR 法分别对Lx3与工L一6进行了不同作用时间和不同IL一6作用剂量的研究, 结果时间表达谱和剂量表达谱都显示了LX3和IL一6的作用密切相关。 为对新基因进行研究,确定新基因在多组织中的表达状态,对基因 进行功能预测分析是必要的。我们用随机引物法制备了用32P标记Lx3 的全长cDNA探针,进行了LX3基因的多组织核酸分子膜杂交即Northern blot。结果显示:LX3基因在脑、心、肝、肺、脾、翠丸、骨骼肌等人 体八种组织中皆有不同程度的表达,其中在肇丸和脾脏中表达较高,而 在脑、胃中表达相对较低。由于脾脏为淋巴细胞生发中心,而Lx3基因 在脾脏中高表达,提示我们该基因很可能与淋巴细胞的增殖与分泌的某 些功能相关;同时Lx3蛋白质在人肇丸组织中的高表达,提示该转录本 可能与男性生殖腺的某些功能相关。 为进一步研究LX3基因编码蛋白质的表达特征,我们进行了LX3编 码蛋白质在细胞中的分布状态(即细胞的位)定位研究。构建了表达绿 色荧光蛋白的真核融合表达质粒pEGFP一Nl/LX3,采用Lipofectin试剂 转染真核细胞293T、NIH3T3,通过Confocal共聚焦荧光显微镜观察细 胞内LX3一GFP的荧光分布,以判断该融合分子在细胞内的定位情况,结 果表明LX3编码的蛋白质为全细胞分布。 3.人功能未知新基因LX3的原核表达、纯化及功能的初步研究。 为验证生物信息学及实验生物学预测的LX3基因表达蛋白质的可能 3 博l学位论文 中文摘要 功能。构建了克隆载体pGEM一T easy/LX3,DNA测序正确后亚克隆到带 有6个His标签的原核高效融合表达载体pET28a(+)上,并转化大肠杆 菌BL21和JMIOg。进行了pET28a(+)/Lx3的融合表达研究及表达条件的 优化。结果表明在20℃,0.Zllunol/L IPTG条件下诱导12h时LX3的表达 量最高,表达量达到20%,且为可溶性表达。 利用融合表达重组LX3蛋白有His纯化标签的特点,我们采用 TALON钻离子亲和层析柱,对重组蛋白LX3进行了纯化。结果表明在 平衡缓冲液Extraetion/Wash Bufl七r为50mmol/L PB+500 mmol/L NaCI(PH 7.0),而洗脱缓冲液Elution Buffer是SOmmol/L PB+500枷01/L NaCI+150 Inlnol/L咪哇(PH 7.0);平衡速度为smU而州cm,洗脱速度为0.5一1.0 ml/mi可cm的条件下,获得了较纯的的蛋白质。纯度达90%以上。 在Lx
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R392.1

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 曹金锁;猪Akirin2基因的分子克隆及体外诱导表达[D];西北农林科技大学;2010年
【参考文献】
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 阮烨,王晓云,谢庆东,黄天华;外源DNA转染精子的实验研究[J];癌变.畸变.突变;2004年03期
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10 张秀华;王文锋;;微卫星DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术的探讨[J];山东农业科学;2009年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 庄绪静;曹雅忠;李克斌;尹姣;;同源建模和分子对接方法的应用与发展[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
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7 马晓东;陈珊珊;李重九;;丙酰紫草素对烟草花叶病毒外壳蛋白的钝化作用研究初探[A];2008年全国有机质谱学术会议论文集[C];2008年
8 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫表面抗原SAG2基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
9 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫致密颗粒蛋白GRA4基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
10 唐小江;马争;黄建勋;黄汉林;李来玉;牛侨;;正己烷引起红细胞膜血影蛋白交联的研究[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘栋;畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D];山东农业大学;2010年
2 贺厚光;双调控溶瘤腺病毒携带超抗原SEA基因治疗前列腺癌基础研究[D];苏州大学;2010年
3 许光辉;基于基因芯片技术的刺五加改善果蝇睡眠作用的机制研究[D];黑龙江中医药大学;2010年
4 徐先伟;定喘穴埋针对哮喘大鼠STAT6 EOTAXIN C-FOS蛋白mRNA表达及相关因子的影响[D];黑龙江中医药大学;2010年
5 郭新军;拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究[D];陕西师范大学;2010年
6 谷风林;酪蛋白美拉德产物的制备、性质及在烟草中的应用研究[D];江南大学;2010年
7 梁勇;白念珠菌高铁还原酶基因表达调控及Aft2p转录因子的功能研究[D];南开大学;2010年
8 张皓;针刺镇痛机制中内源性SS与信号转导机制的研究[D];山东中医药大学;2010年
9 于双妮;胰腺癌差异表达microRNAs的鉴定及功能研究[D];北京协和医学院;2008年
10 吴达;甘肃棘豆生物碱抗肝癌活性及其对荷瘤小鼠免疫功能影响的研究[D];西北农林科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 赵付伟;猪Ⅲ型干扰素IFN-λ1的克隆、表达和抗病毒活性研究[D];华中农业大学;2010年
2 王艳伟;PRRSV感染激活RANTES产生的信号通路研究[D];华中农业大学;2010年
3 白家媛;樱桃谷鸭CD8α胞外区多肽的原核表达、抗体制备及初步应用[D];华中农业大学;2010年
4 朱晓娟;重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL的构建、表达、纯化及初步鉴定[D];南京医科大学;2009年
5 钱静;携带Apoptin双调控溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究[D];浙江理工大学;2010年
6 郑碧;家蚕小热休克蛋白22.6的克隆表达与功能初步分析[D];浙江理工大学;2010年
7 庄文华;家蚕ras oncogene (Bras2)的表达、纯化以及特性分析[D];浙江理工大学;2010年
8 马良;家蚕BmIBP基因的原核表达及其亚细胞定位研究[D];浙江理工大学;2010年
9 李婷婷;家蚕BmNADHb5的表达分析及其亚细胞定位[D];浙江理工大学;2010年
10 刘靓珏;家蚕RPA43相关基因(BmRPA43 N)的克隆表达及定位分析[D];浙江理工大学;2010年
【同被引文献】
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1 孙柏欣;刘长远;陈彦;赵华;赵彤华;李柏宏;;基因表达系统研究进展[J];现代农业科技;2008年02期
2 石鸥燕;杨文万;;生物信息数据库及其利用[J];包头医学院学报;2006年03期
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6 高磊;李霞;郭政;朱明珠;李彦辉;饶绍奇;;结合蛋白质互作与基因表达谱信息大范围预测蛋白质的精细功能[J];中国科学C辑:生命科学;2006年05期
7 郁毅刚,徐如祥,姜晓丹,柯以铨;神经细胞膜NMDA受体蛋白单分子胶体金标记扫描电镜定位研究[J];解放军医学杂志;2004年08期
8 程明;戴闽;;NF-κB振荡的研究进展[J];江西医学院学报;2009年10期
9 郑颖;王文平;金正吉;赵奕文;王建军;;不同转染方法对荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞影响的实验研究[J];中国临床医学;2008年05期
10 张德礼,丁培国,凌伦奖,陈润生,马大龙;人类新基因C17orf32的电子克隆和编码区序列RT-PCR验证[J];生物化学与生物物理进展;2002年04期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 李淑娟;六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究[D];西北大学;2007年
【二级引证文献】
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1 代飞;鸭Akirin2基因的克隆、序列分析及在组织和成肌细胞中的表达特性分析[D];四川农业大学;2012年
【二级参考文献】
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【相似文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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中国重要报纸全文数据库 前4条
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2 麦迪信;血液流动促进心脏“发育”[N];医药经济报;2003年
3 雷毅;科学殿堂里的人们[N];科技日报;2000年
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7 张东;转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
8 王泽英;Clusterin基因在奶牛乳腺炎中的作用及表达调控机制[D];南京农业大学;2012年
9 赵阳;玉米HD-Zip转录因子家族抗旱相关基因的鉴定及Zmhdz10功能分析[D];安徽农业大学;2013年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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5 连爱娥;基于基因本体(GO)的基因语义相似性度量方法的研究及应用[D];上海师范大学;2010年
6 丁健;spoT基因在幽门螺杆菌定植过程中的功能研究[D];山东大学;2010年
7 郭小毛;Igf2基因在克隆胚胎早期发育过程中异常印记模式的研究[D];四川农业大学;2012年
8 张旭;人HSPC117基因对细胞迁移行为影响及基因表观调控的初步研究[D];东北农业大学;2013年
9 李懿星;雄性不育TDR下游基因Os503的筛选验证及其功能研究[D];湖南农业大学;2010年
10 马学敏;植物固醇合成途径关键基因CPI1的进化及功能研究[D];北京林业大学;2013年
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