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《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
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KIR和MHC Ⅰ类分子基因共转移建立异基因骨髓移植双向免疫耐受

吴岚晓  
【摘要】: 移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)和移植排斥严重影响异基因骨髓移植(allogenic bone marrow transplantation,allo-BMT)的成功率,是临床亟待解决的问题。杀伤抑制受体(killer inhibitory receptor,KIR)分子存在于NK、T细胞以及某些单核巨噬细胞、B细胞表面,能识别自身组织细胞特定MHC Ⅰ类分子,建立抑制信号传导通路,消除T、NK细胞毒活性,减少炎性细胞因子的分泌并降低TCR分子的表达。移植排斥发生的部分原因是供者组织细胞不表达与受者KIR分子相适应的MHC Ⅰ类分子,导致受者NK、T细胞的活化不能被抑制,而引发对供者的攻击。同理,GVHD的发生是由于供者的免疫细胞缺乏与受者MHC Ⅰ类分子相配的KIR,不能在被活化的供者免疫细胞和受者组织细胞之间建立抑制性信号传导通路,供者淋巴细胞必然攻击受者,从而发生GVHD。在不能完全改变受者体细胞遗传表型的情况下,本研究拟将受鼠KIR分子和MHC Ⅰ类分子基因共转移入供鼠的骨髓和脾细胞中,使其有效表达,令供鼠造血免疫细胞携带受者KIR和MHC Ⅰ类分子后,进行异基因骨髓移植。通过KIR与MHC Ⅰ类分子双向特异性结合,建立杀伤细胞的抑制性信号传递通路,诱导个体特异性免疫耐受,达到预防GVHD及移植排斥的双重目的。 方法:(1)利用RT-PCR技术克隆BALB/c(H-2~d)小鼠的KIR分子——Ly49A和MHC Ⅰ类分子——H-2D~d的编码基因,构建Ly49A和基因重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ly49A(puro~+)和pMSCV-H-2D~d(neo~+)。(2)将重组病毒表达载体分别转染入PT67细胞,在PT67细胞中包装成具有感染能力的病毒颗粒,将两种重组逆转录病毒共同感染C_(57)BL/6小鼠骨髓细胞和脾细胞,免疫荧光和流式细胞仪检测病毒感染细胞外源Ly49A和H-2D~d基因的表达。(3)采用CFU-Mix克隆培养、淋巴细胞增殖实验、混合淋巴细胞培养、测定CTL杀伤和NK细胞杀伤活性等方法,体外研究转基因细胞的造血功能、免疫功能及杀伤瘤细胞作用。(4)将转基因细胞分别用于C_(57)BL/6(H-2~b)→BALB/c(H-2~d) 异基因骨髓移植GVHD和排斥反应动物模型中,记录动物生存期并观察 GVHD症状,测定移植后血清IL一2水平和骨髓细胞嵌合体形成的比率,分析 受鼠来源的KIR和MHCI类分子基因转移对骨髓移植小鼠GVHD和排斥反 应的作用。 结果:(l)限制性内切酶鉴定、DNA测序分析表明,成功克隆并构建了 BALB/e(H一Zd)鼠的Ly49A和H一ZDd的重组逆转录病毒表达质粒pMsev-H一Znd (neo+)和pMscv-Ly49A印uro+),构建的重组表达质粒中的外源基因方向、序 列均正确。(2)两种重组表达质粒在PT67细胞中包装成具有感染能力的病毒 颗粒,产生病毒滴度在5.8又105一3.4xl06cfi对ml之间。两种重组逆转录病毒共同 感染C57BL场骨髓细胞和脾细胞后,免疫荧光显示细胞表面两种外源分子均得 到表达,流式细胞仪检测病毒感染2天后同时表达外源切49A和H一ZDd基因 的脾细胞和骨髓细胞的比例分别达到48.3土3.7%和13.肚2.3%,病毒感染后经 抗生素筛选4周后则为62.4习.9%和18.1=1=2.6%。(3) CFU一Mix培养证明,病 毒感染的C57BL16鼠骨髓细胞的造血克隆形成能力与未感染的C57BL/6鼠脾细 胞相比,无统计学差异(P0.05)。病毒感染后淋巴细胞对Co叭的刺激反应 无影响。混合淋巴细胞培养结果表明,Ly49A和H一ZDd双基因逆转录病毒共感 染的Cs7BL/6鼠淋巴细胞对BALB/c鼠脾细胞的刺激强度或应答程度,与未感 染感染的C57BL/6鼠骨髓细胞相比,均减弱。双基因转移的C57BL/6鼠脾细胞 与BALB/c鼠脾细胞之间的相互CTL和NK细胞杀伤作用亦减弱,而经病毒 感染的C57BL/6小鼠对BALB/c鼠肿瘤细胞WEHI3的CTL杀伤活性并不改变, 对YAC一1细胞的NK活性亦无变化。(4)在动物模型中,与GVHD阳性对照 组(12.4士1.33天)相t匕,Ly49A单基因转移组(27.6士4.27天)、H一Znd单基 因转移组(19.0士x.77天)及切49A联合H一Znd双基因转移组(33.7士5.22天) 均能显著延长移植小鼠的存活期(P值分别为0.0006、0.0072、0.0001)。转基 因治疗有效组小鼠的一般状况如精神、活动等表现较好,体重减轻较少,外周 血白细胞低下的时间更短。移植后14天,血清IL一2检测显示,H一ZDd单基因 转移组(3.01士o.32ng/ml)、切49A+H一Znd双基因转移组(2.4狂o.42ng/ml)小 鼠IL一2水平较对照组(4.48士0.028n创ml)显著降低(p=0.000、0.000)。组织 病理检查及骨髓细胞嵌合体的检测均证实了Ly49A和H一ZDd双基因转移对骨 髓移植后GVHD和排斥反应的防治效果。 结论:(l)采用逆转录病毒介导,将BALB/。小鼠Ly49A和H一ZDd基因 共转移入C57CU6鼠脾细胞和骨髓细胞中,并在细胞膜表面得到表达。(2) 切49A十H一ZDd双基因转移能降低体外培养的Cs7BL/6鼠免疫细胞与BALB/c 小鼠免疫细胞间的刺激作用和应答强度,减弱细胞之间的相互CTL和NK细 胞杀伤作用,但不影响Cs7BL/6鼠免疫细胞对有丝分裂原的反应及对瘤细胞的 杀伤。(3)在异基因骨髓移植动物模型(Cs7BL/6~BALB/c)中,Ly49A+H一ZDd 双基因转移可延长移植小鼠的生存期,减轻GVHD组织损伤,降低血清IL一2 水平,利于移植后嵌合体的形成。(4)将受者的KIR及M
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R392.1

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