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《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
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HBV转录后调节序列在非细胞毒机制中的作用及其异质性的生物学意义

邢同京  
【摘要】: 对乙型肝炎病毒转录后调节序列(HPRE)在非细胞毒机制中的作用及其异质性的生物学意义进行研究,探讨IFN-γ、TNF-α和IFN-α对乙型肝炎病毒转录后调节的影响。 体外构建含有HPRE片段的pDM138质粒(含有CAT报告基因),应用脂质体介导方法转染HepG_2细胞,观察细胞因子对重组质粒载体CAT报告基因活性表达的影响,CAT基因活性检测采用ELISA试剂盒。结果成功构建了含有HPRE片段的重组质粒载体。转染重组质粒的HepG2细胞CAT活性表达明显增强,而转染空载体的HepG2细胞仅有本底表达。IFN-γ和TNF-α对转染重组质粒的HepG2细胞CAT活性表达的影响均具有浓度依赖性,而对空载体CAT活性的表达无影响。转染重组质粒的HepG2细胞在未加入细胞因子时,其CAT表达活性为896.5±213.6 pg/ml:加入IFN-γ、TNF-α及IFN-γ+TNF-α作用48h后,其CAT表达活性分别为324.4±56.8,395.8±82.3,175.3±35.6pg/ml,与未加入时比较,t=5.19,4.39,6.68,P<0.01,差异有显著性。提示IFN-γ和TNF-α可能通过抑制HPRE的功能,调控乙型肝炎病毒基因的表达。 采用PCR反应产物直接测序法,对31例中国南方HBV感染者血清HBVDNA的HPRE片段扩增后测序,与Genbank中来源于欧美白种人群HBV感染者HBVDNA序列进行比较,并结合临床资料进行分析。结果显示前者HPRE的β_2区,存在3个位点变化,分别为1504nt(T→C),占75.0%;1508nt(C→T),占57.1%;C→G,占10.7%;1509nt(C→T),占60.7%;在后者HPRE序列中均未发现上述位点变化。HPRE位点差异与HBVDNA水平未见明显相关。提示黄种人与白种人群HBV感染者的HPRE序列存在差异位点。 应用定点突变技术,体外构建含有HPRE位点变异的重组质粒载体,观察HPRE位点变异对HPRE功能以及细胞因子抗HBV机制的影响。经测序证实,成功构建了含有HPRE变异位点的重组质粒载体。与野生株比较,1504nt突变株的CAT活性明显升高,差异有显著性;1508nt突变株则无明显变化。在IFN-γ或/和TNF-α作用下,三种突变株的CAT活性均明显下 降,在正N一a作用下,1504nt突变株和巧以+1 508nt突变株的CAI,表达活 性明显降低,差异有显著性(P0.01);而1508nt突变株的C户a,表达活性无 明显变化(P0.05)。提示HPRE15O4nt位点变异可能影响HPRE功能,而 1508nt位点变异可能逃逸了正N一Q对HPRE的抑制作用。
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R346

【参考文献】
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