收藏本站
《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

EBV易感转基因小鼠动物模型的建立

吕丽春  
【摘要】: 细胞恶变是一个非常复杂且受多种因素影响的过程,除了EB病毒感染外,鼻咽癌的发生还与遗传因素、环境因素以及生活习惯等有关。随着研究的深入,EB病毒在NPC发生、发展中的作用日益受到重视。 EB病毒感染的宿主范围极其狭窄,仅能感染人及少数几种灵长类动物。病毒感染的靶细胞主要有两种:B淋巴细胞和复层鳞状上皮细胞,B细胞源性肿瘤如伯基特氏淋巴瘤和免疫母细胞性淋巴瘤、上皮细胞源性肿瘤如鼻咽癌均与EBV感染密切相关。EBV感染B淋巴细胞的途径已十分清楚,B细胞表面存在EB病毒受体CR2,CR2原为补体C3d的受体,因EB病毒主要壳膜糖蛋白gp350/220的分子结构与C3d高度相似,故可经过该受体进入细胞。 EB病毒如何进入上皮细胞,其机制至今未明,可能通过以下途径:(1)通过与上皮细胞表面的CR2受体结合;(2)作为免疫复合物的一部分进入被感染细胞;(3)通过产病毒细胞与上皮细胞间的直接接触或与粘膜细胞融合而感染上皮细胞;(4)在辅助因子/辅受体的帮助下感染细胞,或在辅病毒的帮助下转变为能感染上皮细胞的假型。 在研究EBV与NPC关系中最常遇到的问题就是,在体外培养过程中EBV不能直接感染人正常上皮细胞,更谈不上转化上皮细胞,从而构建出具有代表性的NPC细胞系。寻求建立EBV易感的适当细胞及整体动物模型一直是研究者们追求的方向。本研究在这方面进行了尝试,借助于转基因技术将病毒受体基因导入小鼠鼻咽部上皮细胞,以期能建立近似于自然感染EBV的小鼠动物模型,为研究EBV与NPC的关系奠定良好的 实验动物基础。 本文进行了如下研究: (一)转基因载体的构建:PCR法扩增ED一L2启动子,利用基因重 组技术,分别构建pEDLZ一hCRZ/PEDLZ一p工gR上皮特异性表达载体,经限 制性内切酶鉴定及测序证实获得目的基因正向插入克隆; (二)转基因载体体外转染实验及载体特异性分析:利用脂质体法 分别将pEDLZ一hCRZ/pEDLZ一p工gR两种载体转染人表皮细胞HaCaT和小鼠 鼻咽上皮细胞TMNE,建立了稳定表达上述两种受体的克隆细胞,通过 RT一PCR和免疫组化方法证实目的基因在宿主细胞内转录和蛋白质表达水 平均正确。同时还瞬时转染了人胚肺细胞Wl一38、人结肠腺癌细胞LOVO 和鼠成纤维细胞NIH3T3,目的基因在W工一38及NIH3T3细胞内不表达, 在LOVO细胞内的表达水平,与转染空载体及空白对照细胞基本一致,提 示ED一L2启动子在宿主细胞内能正确调控目的基因的表达。 (三)体外病毒感染实验:对稳定转染CRZ/plgR的HaCaT、TMNE细 胞,在体外培养过程中分别用EBV、EBV+TPA及T以处理,两种受体阳性 细胞EBV/EBV+T以处理组均能感染上病毒,PCR及Southern Blot能检 测到EBV BamHIW片段,EBER一1原位杂交阳性,感染率在18.96%一32.82 %之间,病毒对HaCaT细胞的感染率明显高于TMNE细胞(P0.05)。电 镜下在TMNE一CRZ/T MNE一plgR细胞内均找到病毒颗粒,确证目的蛋白 CRZ/p工gR在鼠源性TMNE细胞内也能正确发挥其生物学功能。转染受体 的TMNE细胞在体外能感染上EB病毒,直接提示携带EB病毒相关受体的 转基因鼠,其鼻咽部上皮是完全有可能感染上EB病毒的。 (四)CRZ/plgR转基因小鼠的建立:将pEDLZ一hCRZ/pEDLZ一plgR载 体双酶切后,仅保留启动子+目的基因片段,通过显微注射的方法,分别 注射入小鼠受精卵,注射后受精卵的成活率约40%~50%,移入假孕母 鼠体内,约6%左右的移植胚胎可以发育正常足月,产下CRZ、plgRFO 代鼠28、47只,PCR检测分别有11、15只阳性,Southern Blot分析各 有4、6只鼠阳性,阳性率分别为14.28%、12.77%。plgR FO代southern 杂交阳性鼠雌雄交配或与正常鼠合笼,产下plgRFI代鼠71只,PCR检 测23只阳性,Southern杂交7只阳性,阳性率为9.86%。分别处死 Southern杂交阳性CRZ FO及plgR FO/FI代转基因鼠各1只,免疫组化 一6- 显示目的蛋白在p工gRFO代转基因鼠的鼻咽、食道上皮能正常表达,气 管、胃、肠、肾等上皮无表达;但目的蛋白在CRZFO、plgRFI代鼠鼻 咽、食道和舌头上皮无明确表达。对Southern Blot鉴定为阳性的鼠, 用EBV+TPA隔日滴鼻处理,最长时间达3个月,未能观察到小鼠感染上 EBV,ELISA检测转基因鼠外周血EBV一IgG均呈阴性。 本实验首次建立了鼻咽部特异性表达EB病毒受体的转基因鼠,虽未 能观察到动物感染上了EB病毒,但我们的实验在EBV易感动物模型方面 进行了有益的尝试,如能对实验进行进一步的改进,也许在不久的将来 将会取得突破。
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R-332

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 姚开泰;从死因回顾调查资料看湖南省鼻咽癌流行病学的一些特点并探索其发病机理[J];湖南医学院学报;1982年01期
2 肖志强,姚开泰,刘薇,卢光 ;携带EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因小鼠的制备[J];生物化学与生物物理进展;1995年02期
3 郭秀婵,盛望,张永利,黄燕萍,T Ooka,曾毅;Epstein-Barr病毒BARF1基因协同TPA诱发猴肾上皮细胞恶性转化的研究[J];中华实验和临床病毒学杂志;2001年04期
4 孙宁,陈小毅,吴枫,郭忠民,沈淑静;促癌剂协同下Epstein-Barr病毒体内外感染引起人胚鼻咽上皮的形态学改变[J];中华实验和临床病毒学杂志;1998年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 文冬生,潘世宬,陈琼鹏,黄季良,肖家声;二甲基苯蒽和二亚硝基哌嗪诱发大鼠鼻咽癌的综合作用研究[J];湖南医学院学报;1985年01期
2 任彩萍,蓝轲,刘卫东,何志巍,王慧,姚开泰;小鼠补体受体Ⅱ型基因改造后感染EB病毒[J];湖南医科大学学报;2001年02期
3 王浩,李硕颀,张磊,张静,戴伟;湖南省鼻咽癌非病毒影响因素的条件logistic回归分析[J];中南大学学报(医学版);2005年03期
4 熊国军;;鼻咽癌高发家族外周血姐妹染色单体交换[J];川北医学院学报;1988年03期
5 何迎春;田道法;贺安意;江洁琼;刘宇勤;;重组质粒pLMP1-p53mt在人鼻咽癌HNE1和人宫颈癌HeLa细胞中的表达分析[J];中华肿瘤防治杂志;2006年06期
6 李峰,蒋卫红,杨旭宇,尹志华,冯湘玲,刘卫东,王磊,周文,姚开泰;鼻咽癌相关基因NAP1的克隆及鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2004年05期
7 陈江;朱冠保;;EBV感染与胃癌关系的研究进展[J];世界华人消化杂志;2011年29期
8 曾健;李友琼;王文红;杨莉;訾瑞峰;张雪怡;周天戟;;EB病毒BARF1蛋白诱导胃癌细胞c-met和Bcl-2基因过表达[J];江苏医药;2010年08期
9 唐祖明;高健;何长伦;王一淳;戴宇东;王寿明;郑纪山;;乙型肝炎病毒感染者B淋巴母细胞系的建立[J];医学研究杂志;2008年09期
10 蒋卫红,肖健云,赵素萍;EB病毒基因BARF1在鼻咽癌中的表达及其意义[J];中国耳鼻咽喉颅底外科杂志;2004年06期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 黄华;6p21.3区域鼻咽癌相关基因及其单核苷酸多态性[D];第一军医大学;2002年
2 蒋卫红;EB病毒在鼻咽低分化鳞癌中的感染状态及其分子机理的研究[D];中南大学;2003年
3 韩为农;鼻咽低分化鳞状细胞癌的分子分类[D];中南大学;2003年
4 黄仲曦;生物信息学初步探索鼻咽癌发病机理[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
5 江培洲;EBV与TPA分别及协同处理CNE2细胞诱导基因表达差异的蛋白质组学研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
6 何英;7个鼻咽癌相关基因单核苷酸多态性的筛查及其与鼻咽癌易感性的关联分析[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
7 杨玉芳;用LMP1构建重组慢病毒载体及建立转基因小鼠模型[D];第一军医大学;2004年
8 张庆玲;LMP1转基因小鼠构建及功能初步研究[D];第一军医大学;2006年
9 谢卫兵;利用RNAi技术研究CTSD和MMP1在鼻咽癌转移中的作用[D];第一军医大学;2006年
10 童永清;鼻咽癌T7噬菌体cDNA文库的构建和鼻咽癌血清自身抗体的筛选[D];中南大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘珊;98例鼻咽癌患者出院后生活质量与应对方式的相关性分析[D];中南大学;2003年
2 徐守军;EB病毒与Okadaic Acid分别及协同处理HNE—1细胞的蛋白表达谱[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
3 王爽;鼻咽低分化鳞状细胞癌分子分类的初步研究[D];第一军医大学;2004年
4 张贺军;LF基因在鼻咽癌细胞系中遗传学和表遗传学改变及其功能纠正的初步研究[D];中南大学;2007年
5 杨涌;错配修复基因hMLH1、hMSH2在鼻咽癌中的蛋白表达及临床意义[D];广西医科大学;2008年
6 徐芳;EBVBARF1基因真核表达载体的构建及其在胃癌细胞系SGC-7901中的表达[D];江苏大学;2008年
7 单文姣;LTF基因在鼻咽癌中的表达及其与甲基化的关系[D];中南大学;2008年
8 李友琼;EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞系SGC7901生物学行为的影响[D];江苏大学;2009年
9 龚辉成;从基因芯片结果中筛选鼻咽癌信号转导相关基因及初步验证[D];广州医学院;2009年
10 曾健;EB病毒编码的BARF1基因通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路改变胃癌细胞生物学行为机制的初步研究[D];江苏大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;趋势面分析及其在肿瘤死亡回顾性调查中的应用[J];湖南医学院学报;1980年01期
2 姚开泰,潘世宬,黄季良,文冬生;二亚硝基哌嗪诱发大鼠鼻咽癌的进一步研究[J];湖南医学院学报;1981年01期
3 姚开泰;从死因回顾调查资料看湖南省鼻咽癌流行病学的一些特点并探索其发病机理[J];湖南医学院学报;1982年01期
4 ;亚硝胺类化合物诱发大鼠鼻咽癌的实验研究[J];科学通报;1978年12期
5 陈南岳;蛋白激酶C在细胞生长与恶变过程中的调控作用[J];生物化学与生物物理进展;1991年04期
6 肖志强,姚开泰,刘薇,卢光 ;携带EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因小鼠的制备[J];生物化学与生物物理进展;1995年02期
7 蓝轲;EB病毒BNLF-1基因研究的新进展[J];生命科学;2001年01期
8 蓝轲,甘润良,任彩萍,何志巍,谢鹭,姚开泰;稳定表达鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1基因的鼻咽癌细胞系的建立[J];中国病理生理杂志;2001年02期
9 陈小毅,孙宁;良、恶性鼻咽活检组织中EB病毒DNA检测、EBNA的分型及表达[J];中华病理学杂志;1994年04期
10 梁克;EB病毒DNA转染胎儿鼻咽纤维细胞[J];中华肿瘤杂志;1994年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;对鼻咽癌诊治的几点体会[J];天津医药;1974年11期
2 ;儿童中的鼻咽癌[J];国际耳鼻咽喉头颈外科杂志;1978年S1期
3 汤雪怀;;温州地区鼻咽癌的流行情况及病因初步探讨[J];温州医学院学报;1978年01期
4 ;法国著名肿瘤专家德泰(Guy de Thé)博士来湘讲学和座谈简纪[J];中南大学学报(医学版);1980年02期
5 李敏民;广州市举行国际鼻咽癌学术会议[J];肿瘤;1982年03期
6 曹弃元;人白细胞干扰素治疗鼻咽癌[J];实用癌症杂志;1986年03期
7 姚钢青,李以莞,田海梅,杨治华,衣林,赵志辉;鼻咽癌癌基因研究 I.鼻咽癌细胞株CNE-2DNA的转化活性[J];中国医学科学院学报;1989年02期
8 贾超英;;白种人儿童的鼻咽癌研究[J];国际耳鼻咽喉头颈外科杂志;1989年01期
9 严洁华,徐国镇,胡郁华;对局部顽固性鼻咽癌处理的研究(Ⅳ)[J];中华放射肿瘤学杂志;1990年03期
10 张忻宇,邹存玮,王明广,毕卫群,李子祥;鼻咽癌临床误诊分析—对分泌性中耳炎的认识[J];山东医药;1992年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 宋新貌;;鼻咽癌危险因素的流行病学调查[A];华东六省一市耳鼻咽喉-头颈外科学术会议暨2008年浙江省耳鼻咽喉-头颈外科学术年会论文汇编[C];2008年
2 孙颖;毛燕萍;李文斐;陈磊;刘立志;唐玲珑;曹素梅;林爱华;卢泰祥;刘孟忠;李立;洪明晃;马骏;;鼻咽癌2008分期的临床验证[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年
3 许婷婷;胡超苏;高云生;张有望;应红梅;朱国培;吴永如;何霞云;孔琳;;化疗在T2bN1M0期鼻咽癌患者中的价值[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年
4 张云霞;陆雪官;唐军;张力元;;~(99m)Tc-EC-MN SPE CT显像预测鼻咽癌乏氧的临床初步研究[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年
5 蒋春灵;李金高;叶莘千;;鼻咽癌原发灶消退速度和肿瘤预后的关系[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年
6 钟兴;徐浩;弓健;郭斌;;hNIS转染介导放射性核素显像和治疗鼻咽癌及其机制研究[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
7 朱小东;苏芳;曲颂;王琪;李力;张玮;;鼻咽癌患者放疗前后血清蛋白质谱变异性研究[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年
8 路娜;冯林春;蔡博宁;王运来;解传滨;;鼻咽癌螺旋断层放疗过程中靶区和危及器官变化规律及其临床意义的探讨[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年
9 张旸;张红星;王志富;李佩尧;虞立霞;贺福初;周钢桥;;端粒酶催化亚基启动子区单核苷酸多态性rs2853669与鼻咽癌的遗传关联研究[A];遗传学与社会可持续发展——2010中国青年遗传学家论坛论文摘要汇编[C];2010年
10 谢伟敏;胡晓桦;刘志辉;廖萍;周文献;;奈达铂单药治疗晚期复治鼻咽癌的Ⅱ期临床观察[A];第七届广西肿瘤学术年会论文汇编[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王海滨;鼻咽癌治疗后必须定期复查[N];潮州日报;2009年
2 湖南省疾病预防控制中心副研究员 柳君;鼻咽癌的早期症状[N];保健时报;2009年
3 本报实习记者 胡珉琦;贝锦新:找到“广东瘤”基因[N];北京科技报;2010年
4 湘雅二医院耳鼻喉科教授 曾益慈;如何早期发现鼻咽癌[N];大众卫生报;2001年
5 程心超;八大表现与鼻咽癌有关[N];健康报;2004年
6 刘江峰;如何早期发现鼻咽癌[N];健康报;2005年
7 本报特约记者 张秀花;粒子植入治鼻咽癌[N];健康时报;2003年
8 吴静;反复出现带血鼻涕———警惕鼻咽癌[N];中国医药报;2002年
9 记者 李天舒 通讯员 黄金娟;评估鼻咽癌预后有新标志物[N];健康报;2011年
10 吴静;鼻涕带血警惕鼻咽癌[N];保健时报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吕丽春;EBV易感转基因小鼠动物模型的建立[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
2 李兵;bcl-2与c-erbB-2反义寡核苷酸联合转染治疗鼻咽癌的实验研究[D];重庆医科大学;2004年
3 邱士军;~1H-MRS化学位移成像在鼻咽癌放疗后放射性脑损伤中的应用研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
4 周小军;鼻咽癌高危人群体质特征及其发病学意义的临床与实验研究[D];湖南中医学院;2002年
5 庞学利;鼻咽癌放射治疗相关解剖及临床剂量学研究[D];第三军医大学;2004年
6 黄卫国;鼻咽癌14-3-3σ蛋白的靶向蛋白质组学研究[D];中南大学;2010年
7 蒋卫红;EB病毒在鼻咽低分化鳞癌中的感染状态及其分子机理的研究[D];中南大学;2003年
8 崔晓波;鼻咽癌肿瘤抗原的血清学筛选及表达研究[D];四川大学;2005年
9 李建成;鼻咽癌的束流调强放疗[D];复旦大学;2005年
10 王贤文;鼻咽癌前病变证素计量辩证规范及其相关蛋白质组学基础研究[D];湖南中医药大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄水仙;细菌感染与鼻咽癌细胞增殖活性的关系及五味消毒饮的干预作用[D];湖南中医学院;2004年
2 费召东;原发肿瘤体积对鼻咽癌调强放疗预后的影响[D];福建医科大学;2011年
3 崔朝阳;抑癌基因PTEN、P21waf1在鼻咽癌中的表达及其临床意义[D];福建医科大学;2002年
4 郑红;鼻咽癌中DNA聚合酶β基因突变及与EB病毒相关性研究[D];郑州大学;2004年
5 刘颖新;MMP-9、LMP-1蛋白在鼻咽癌中的表达及其与远处转移的相关性研究[D];广西医科大学;2004年
6 毛圆;人源抗EB病毒LMP1抗体Fab联合丝裂霉素C对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用[D];南京医科大学;2011年
7 陈志坚;鼻咽癌鼠移植瘤建立及鼻咽癌病人免疫状况研究[D];汕头大学;2001年
8 龚伟;鼻咽癌调强放疗中正常器官体积剂量的变化及其临床意义[D];苏州大学;2010年
9 杨海伟;抑癌基因PTEN在鼻咽癌中表达和突变的研究[D];汕头大学;2004年
10 陈忠杰;鼻咽癌腔内热疗辐射器的实验和临床研究[D];天津医科大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026