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《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
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成年食蟹猴骨髓基质细胞的诱导分化及移植修复脑皮层损伤

李钢  
【摘要】: 研究背景 神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)移植修复神经系统损伤是目前神经医学领域的一个研究热点,但是由于既往从胎脑组织获得NSCs的方法面临细胞数量不足以及伦理学束缚等困难,在临床应用受到限制。骨髓基质细胞多分化潜能的发现和向神经细胞方向定向分化的成功,为神经干细胞的来源增加了一个新的途径。 骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal cells,BMSCs)是骨髓细胞中除去造血干细胞(非粘附细胞)之外的细胞部分(粘附细胞),又称为塑料粘附细胞(plastic-adherent cells)、克隆形成单位成纤维细胞(clone-forming-unit fibroblast cells)或间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。目前研究发现哺乳动物BMSCs可以向多种组织细胞分化,特别是可以分化出来源于外胚层的组织如神经组织,可以将BMSCs诱导成为神经干细胞(NSCs)。由于它可直接从自体骨髓腔抽取或从松质骨获得,来源充足,取材方便,创伤小,自体移植后不受免疫排斥反应及伦理道德的约束,细胞处于未分化状态,增殖能力强,可在体外大量培养扩增,由此获得的神经干细胞称之为“骨髓源性神经干细胞”,因此BMSCs可以作为一种理想的种子细胞。 本实验旨在培养出“骨髓源性神经干细胞”,然后进行脑内移植,观察细胞在脑内存活、迁移等情况。本实验以灵长类动物食蟹猴为实验对象,进行神经干细胞培养及移植实验,为骨髓源性神经干细胞自体移植在临床的开展和应用提供依据。 第一部分:骨髓基质细胞体外培养获得神经干细胞的实验研究 目的: l、观察骨髓基质细胞在体外培养及诱导分化获得神经干细胞的可行 性; 2、摸索并确立骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的适当培养方法及条 件,建立一个获得“骨髓源神经干细胞”的成熟技术平台,为其在组织 工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。 方法: 1、以大鼠(预实验)和食蟹猴为实验对象,无菌穿刺实验动物骨髓 腔抽取骨髓,梯度密度离心获得有核细胞,粘附法提取骨髓基质细胞。 2、提取的骨髓基质细胞悬液加入神经干细胞培养液,调整细胞浓度 到106个/m1后,接种于多孔培养板中,加胎牛血清(l%终浓度)及LIF(1Ong /ml)+b FGF(10ng/ml),在37oC、5%COZ、饱和湿度条件下培养,48 小时后换液以去除非粘附细胞,以后每周换液2次。培养1一2周后得到 较纯化的BMSCs,可进行细胞传代培养,在培养过程中加入胎牛血清以 及RA(终浓度0.5 u g/ml)以诱导BMSCs向神经干细胞分化。 3、观察培养细胞:CKZ型倒置相差光学显微镜(OLYMPAs,JA孙创) 追踪观察细胞生长情况并拍照;采用SABC法进行免疫细胞化学检测(一 抗分别为鼠抗一estin、兔抗双SE、鼠抗一GEAP,二抗试剂盒为生物素化 羊抗小鼠IgG/羊抗兔IgG,链霉亲和素一生物素一过氧化酶复合物),不 同阶段培养细胞经4%多聚甲醛固定,0.olmo比PBS冲洗,一抗37℃60 min;生物素化二抗室温孵育10 min;链霉亲和素一生物素一过氧化酶复 合物室温孵育10 min;DAB显色染色5~15min,着棕色的细胞为阳性, OLYMPAS光学显微镜观察拍照。 结果: 1、贴壁细胞培养48h后有分裂增殖,然后逐渐形成岛屿状细胞克隆 团,给予适当的分化条件10一20d后,这些细胞能分化成具有细长突起、 多种形态的细胞。 2、经免疫细胞化学鉴定,早期的培养细胞在没有给予诱导分化时可 阳性表达Nestin,表明具有干细胞特性;培养细胞经诱导分化后有G队P、 NSE阳性表达的细胞出现,并随着诱导时间的延长,GEAP、NSE阳性 表达的细胞逐渐增多。 结论: 1、哺乳动物骨髓的BMSCs在合适的体外培养条件下能够转化为神 经干细胞,保持增殖分化能力,灵长类动物BMSCs具有同样的特性; 2、目前我实验室采用的培养方案(神经干细胞培养基)适合于食蟹 猴骨髓基质细胞向神经干细胞转化; 3、源自BMSCs的神经干细胞能分化出具有神经系细胞特征的细胞; 4、来源于自体骨髓、培养、诱导获得的具有神经干细胞特征的细胞 来源充足,没有伦理学和免疫排斥的问题,可用于脑内移植实验研究。 第二部分:骨做源神经干细胞自体移植修复脑皮层损伤的实验研究 目的: l、建立脑皮层损伤动物模型后,将源自自体骨髓基质细胞的“骨髓 源性神经干细胞”移植到模型动物脑内,观察其增殖、生长和迁移等情 况; 2、通过采用伤后即时移植和延迟移植“骨髓源神经干细胞”的方法, 观察骨髓源性神经干细胞在创伤不同时期在创伤灶的生长、存活情况。 方法: 1、立体定向辅助下,在实验动物脑皮层的同一部位制作8 X 8 x4~ 皮层创伤灶; 2、在细胞培养室超净台内将已行BrdU标记的骨髓源性神经干细胞 收集、离心,制成干细胞悬液,约0.4一0.sml,细胞数量级大于1010个。 3、将在体外培养、诱导并且标记有B川U的骨髓源性神经干细胞悬 液采用立体定向多点注射法移植到皮层创伤灶及其周围脑组织中; 4、在l、3、6个月分别灌杀动物,取脑固定、切片,SABC法检测, 观察各实验组和对照组动物BrdU阳性细胞的生长、迁移情况。 5、
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R651.1

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