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《中国人民解放军第一军医大学》 2003年
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人胰岛细胞分离纯化的实验研究

赵德明  
【摘要】: 研究背景:胰岛细胞移植是一种非常有前景的治愈糖尿病的手段。虽然既往已经在实验动物模型中成功的根治了糖尿病,但是在临床应用上仍有很多问题需要解决。近年来随着Edmonton方案取得了鼓舞人心的成功,为用胰岛细胞移植的方法治愈1型糖尿病开拓了广泛的应用前景。但是仍有很多问题有待进一步解决,如移植的胰岛细胞需要有足够高的活性才能逆转高血糖状态、移植的胰岛细胞需要足够多的数量、排斥反应、受者再次出现自身免疫反应、简便经济的新方法等等。鉴于在免疫抑制剂、器官获取技术、胰岛细胞分离技术和胶原酶方面取得的进展,我们有理由相信胰岛细胞移植将成为治疗1型糖尿病的最佳选择之一。本实验旨在探讨用常见试剂进行人胰岛细胞的分离与纯化,并利用分离纯化所得到的胰岛细胞进一步研究新型免疫抑制剂对胰岛细胞功能的影响。 目的:1、用两步消化法和试管纯化法初步建立用胶原酶P分离、纯化人胰岛细胞的方法;2、了解Pefabloc和PNGS对胰岛细胞分离纯化的最终产量和胰岛细胞功能的影响;3、用MTT法体外探讨三种不同免疫抑制剂对所分离纯化的胰岛细胞活力的影响。 方法:1、胰岛细胞的分离纯化:按本实验室建立的方法,用胶原酶P两步法消化分离胰腺,用试管法通过不连续密度梯度HC-A-Ficoll纯化 液纯化胰岛细胞。2、通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的 数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。3、通过免疫组 化和透射电镜观察分离纯化的胰岛细胞是否存在胰岛素和胰高血糖素颗 粒。4、通过DTz染色,在倒置显微镜下计数Pefabloc组和PNGS组纯 化胰岛细胞的数量,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。5、采用 MTT法测定三种免疫抑制剂在不同浓度作用下胰岛细胞活力的变化。 结果:1、纯化后平均每个胰腺可获得81444士34631个胰岛细胞团, 平均每克胰腺组织可获得胰岛细胞团1 136士474,平均纯度为74.84%。2、 纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量 为低糖时2.巧的倍(p0.01),免疫组织化学和透射电镜下胰岛素和胰 高血糖素颗粒均为阳性。3、胶原酶P工作液中加入Pefabloc后,每个胰 腺可获得1 10250士28590个胰岛细胞团,平均每克胰腺组织可获得胰岛 细胞团1559士319个,产量高于control组,有显著意义,但对胰岛素释 放刺激反应无明显差别,SI分别为Pefabloc组1.93士0.21和Contr01组 1.86士0.19;纯化液中加入PNGS后,每个胰腺可获得65750士8132个胰 岛细胞团,平均每克胰腺组织可获得胰岛细胞团871士204个,产量高于 Contl’o1组,但统计学上没有显著差别,胰岛素释放刺激反应结果显示, 51分别为PNGS组2.74士0.54和Control组1.86士0.19,PNGS组明显高 于Control组,差别显著。4、低剂量的雷帕霉素对胰岛细胞活力无明显 影响,ing/mL及以上雷帕霉素能引起胰岛细胞活力降低,低剂量和高剂 量的血cli刀口nab和FTY720对胰岛细胞的活力均无明显影响。 结论:1、建立了人胰岛细胞分离纯化的方法。2、Pefabloc能增加 胰岛细胞的产量,PNGS可以保护胰岛细胞。3、雷帕霉素对胰岛细胞有 一定的毒性作用,dach刀田皿ab和FTY720对胰岛细胞无明显毒性作用。
【学位授予单位】:中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R657.5

【引证文献】
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