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《第一军医大学》 2004年
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肾阴虚证相关基因的初步研究

赵晓山  
【摘要】:[背景] 几十年来,国内外学者对肾虚证本质做了大量的工作,初步证实中医肾虚证具有现代病理生理学基础,并阐释了其中医理论的某些细节及其科学性,对肾虚证进行了客观指标的研究。其中对肾阳虚证研究报道较多,而肾阴虚证研究甚少。尽管肾虚证本质研究取得了不少成果,但随着研究工作的深入,同时也带来困惑与迷惘。中医“证”是疾病发生过程中不同阶段病因病机的高度概括,既然同一证有共同的临床表达和病理机制,那么其肯定有共同的物质基础。生命的中心法则:基因型(DNA或基因)处于最原始和最本质的地位,主宰和制约表型(蛋白质→细胞→有机体)程序的发生发展。生命现象、疾病、中医证候都可以从DNA或基因水平的研究获得最本质的答案。中医学认为肾藏精为先天之本,主生长、发育、生殖及水液代谢等。肾所藏之精源于父精母血的生殖之精,是构成胚胎发育的原始物质,其与现代医学描述的遗传物质(即基因组DNA)具有一定的同一性。肾虚证的物质基础是肾精虚损。国内许多专家教授认为人类基因组学研究的方法学内容与中医学的整体观、辨证观有许多相似之处,基因组学研究将是中医学现代化的重大突破口。因此,从基因组方面继续深入研究肾虚证的分子机制对于阐明肾虚证本质有着重要意义。糖尿病。肾病(diabetic nephropathy,DN)是严重危害人们的身体健康的常见病、多发病。亚健康(sub-health)已经成为当今危害人类健康的头号隐形杀手,也是现代医学难题之一。亚健康状态是介于健康和疾病之间的中间状态,与中医证候具有密切关系。研究发现DN和亚健康均可出现肾阴虚证,前者为疾病状态下肾阴虚证,后者为功能状态下肾阴虚证,根据“异病同治”必有其物质基础的理论,我们认为将它们作为研究肾阴虚证相关基因的切入点是非常理想的。 【目的】 从结构基因组学(DNA序列变异)和功能基因组学(基因表达)变 化两方面研究肾阴虚证的相关基因。 【方法】 (1)本研究拟以辨病与辨证相结合,从DN肾阴虚证和亚健康肾阴 虚证入手,应用现代分子生物学技术抑制性消减杂交(suPPression subtractivc hybridization,ssH)、聚合酶ha反应(PCR)、基因克隆、点杂 交(dot blot)等方法分别构建DN肾阴虚证和亚健康肾阴虚证的DNA 消减文库,再运用核酸分子杂交原理和抑制性PCR进一步筛选上述两个 DNA消减文库中的相同部分,然后测序进行同源性分析。 (2)利用基因芯片技术究亚健康状态肾阴虚证与健康的正常人白细 胞的基因表达谱变化。同时根据“以药测证”理论,给予亚健康肾虚证 患者口服六味地黄软胶囊,研究其服药前后基因表达谱的变化,通过统 计分析,得出六味地黄软胶囊的治疗作用相关的基因,即亚健康肾阴虚 证的相关基因。 【结果】 (1)本研究成功地建立了筛选复杂基因组中差异基因的SSH方法。 (2)本研究首次成功地构建了汉族人DN肾阴虚证的DNA消减文 库,经篮白斑筛选后,正向消减文库得到300个克隆,反向消减文库得 到286个克隆。 (3)本研究首次成功地构建了汉族人亚健康状态肾阴虚证的DNA 消减文库,经篮白斑筛选后,正向消减文库得到360个克隆,反向消减 文库得到320个克隆。 (4)本研究构建了DN和亚健康肾阴虚证正向消减文库中的相同部 分(即正向文库),经篮白斑筛选后,得到420个克隆;反向文库(DN 和亚健康肾阴虚证反向消减文库中的相同部分)得到384个克隆。经过 点杂交(dot blot)进一步筛选阳性克隆,分别从正向文库和反向文库中 各抽取20个阳性克隆,进行测序及同源性分析,结果发现正向文库中有 2个克隆测序不成功,3个克隆为DNA重复序列,其他15个克隆涉及到 免疫(如白介素10、白介素28受体、HLA一DR等)、信号传导(如 ealeium/ealmodulin dependent protein kinase 11等)、基因表达调控(如 一3- START、P150等)以及未知功能的基因。反向文库有2个克隆测序不成 功,4个克隆为DNA重复序列,1个克隆未见有同源基因,其他13个克 隆涉及到染色体上的基因阅读框、G蛋白受体、热休克蛋白、转录终止 因子、p40以及未知功能的基因等。 (5)本研究利用基因芯片技术研究了亚健康状态肾阴虚证的基因表 达谱。结果:在芯片2000004874结果中有2607个数据为有效数据,共 有397个基因存在显著性表达差异,其中与对照组(健康的正常人)相 比在实验组(亚健康状态肾阴虚证患者)中有215个基因发生了上调表 达变化,有182个基因发生了下调表达变化;在芯片2000004875结果中 有2807个数据为有效数据,共有221个基因存在显著性表达差异,其中 与对照组(肾阴虚证患者服药前)相比在实验组(肾阴虚证患者服药后) 中有123个基因发生了上调表达变化,有98个基因发生了下调表达变化。 将两次实验的结果进行合并分析,结果发现其中有与免疫、氧化应激、 基因表达调控、物质代谢、信号传导、细胞骨架以及未知功能等相关的 46条基因表达发生了相反的改变,针对实验的设计,我们认为在两次实 验结果中表达变化相反的基因很可能是与六味地黄软胶囊治疗作用相关 的基因,亦即亚健康状?
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R256.5

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【引证文献】
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【同被引文献】
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4 马骏;中医治更年期综合征显优势[N];中国中医药报;2004年
5 ;当代中医药发展与管理改革研究(四)[N];民族医药报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 王学良;亚健康状态流行病学调查及其肾阴虚证的蛋白组学研究[D];南方医科大学;2007年
2 魏敏;肾阴虚证和肾阳虚证基因表达谱的比较研究[D];南方医科大学;2009年
3 孙晓敏;肾阴虚证的血浆蛋白组学初步研究[D];南方医科大学;2008年
4 孙晓峰;功能失调性子宫出血常见中医证候规范化研究[D];湖南中医药大学;2007年
5 张慧兰;益肾法治疗慢性肾脏病的理论与临床研究[D];南京中医药大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 赵毅鹏;绝经后骨质疏松症肾阴虚证相关基因初探[D];福建中医药大学;2011年
2 李俊丽;基于方证相应探寻肾阴虚证的标志蛋白质[D];中国中医科学院;2010年
3 毕建璐;肾阳虚证和肾阴虚证血浆蛋白表达谱的比较研究[D];南方医科大学;2011年
4 邱龙龙;绝经后骨质疏松症肾阴虚证相关基因CLCF1表达的研究[D];福建中医药大学;2013年
5 倪晨波;六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证相关基因CLCF1 mRNA表达的影响[D];福建中医药大学;2014年
6 李伟男;保肾巴布剂穴位敷贴干预亚健康状态肾阳虚证肾阴虚证的临床研究[D];湖北中医药大学;2012年
7 付婷婷;狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的构建[D];第一军医大学;2005年
8 何晓燕;维肾素膏防治亚健康状态肾阴虚证肾阳虚证的临床研究[D];湖北中医学院;2008年
9 崔丽娟;糖尿病肾阴虚证cDNA消减文库的构建[D];第一军医大学;2005年
10 向丽;广防风胶囊治疗肾阴虚证围绝经期综合征的临床研究[D];湖北中医学院;2008年
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