收藏本站
《第一军医大学》 2004年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

T细胞淋巴瘤TCRγ基因重排特征分析及检测方法的优化

韩西群  
【摘要】:研究背景与目的 淋巴瘤在组织和细胞形态学方面与高度反应增生性淋巴组织的鉴别诊断十分困难,容易造成误诊。淋巴瘤病理诊断是临床病理工作的难题之一。目前国内主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段。随着分子生物学的发展,从基因水平研究和分析诊断疾病的技术不断出现并且日趋成熟,为淋巴瘤诊断提供了有效工具。淋巴瘤是由单克隆淋巴细胞增生所致,而反应增生性淋巴组织则来自于多克隆淋巴细胞,这是二者的重要区别。编码免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)的基因经过重排以后,不同克隆之间的重排基因互不相同,因此,基因重排对淋巴瘤的诊断具有特异性价值。以PCR技术为基础的方法以其简便、高效、廉价及适用面广而在淋巴瘤基因重排研究方面越来越受重视。但不同研究文献中所采用的引物、PCR条件、PCR产物检测方法等都不尽相同,结果也有差异。因此,难以找到适于常规临床病理诊断之用的标准程序。Jurkat细胞是T细胞淋巴瘤基因重排研究中常用的阳性对照细胞,但有关Jurkat细胞基因重排的详细情况也未见报道。假基因是Ig和TCR胚系DNA中常见的基因,有关假基因参与重排的情况以及在设计引物方面是否应将假基因包括在内也未见有关研究报道。本实验以TCR基因重排为研究对象,通过优化引物选择、PCR条件及PCR产物的检测方法等,分析T细胞淋巴瘤基因重排检测的最佳方法。同时,分析TCR基因重排的特点,为进一步研究TCR基因重排提供理论和技术支持。 方法 1 以TCR_γ基因重排为研究对象,选用通用引物TVG、V_γⅠ及TCR_γ家族特异性引物为工具。用正交设计实验优化V_γⅠ引物的PCR条件。另选一对TCRβ通用引物作为TCR_γ引物的补充和比较。 2 利用PCR和测序研究Jurkat细胞基因重排情况,分析TCR基因重排的基本特点。 3 PCR产物检测方法①利用TCR通用引物检测淋巴瘤克隆性基因重 排阳性率,分别用琼脂糖电泳和SSCP分析PCR产物;②将PCR产 物分别进行直接测序和克隆后测序,分析TCR基因重排的特点及探 索测序方法在基因重排检测中的应用;③分析PCR产物中DNA的克 隆数与SsCP中条带数目的关系。 4将TCR引物按不同形式组合,分析多重引物PCR条件,观察多重引 PCR可以在多大程度上提高T细胞淋巴瘤的阳性检出率。另外分析 TCRp通用引物的PcR条件及在淋巴瘤中的检出率。 结果 1利用正交设计实验对VYI与反义引物PcR的条件进行优化发现,在 降落式PCR条件下,两条Tm值差别大(分别为72.5℃和51.1℃)的引 物仍可以获得满意的扩增结果。 ZJ川火at细胞免疫表型为TCRap阳性、TC助6阴性。但经PCR和测序 发现,该细胞中存在TCRY双等位基因重排〔vs一JI/2和vIV(假基因卜JI/2]。 v8一JI/2扩增产物在连接区插入和删除的碱基数分别为sbp和gbP;v lv(假基因卜Jl/2扩增产物在连接区插入和删除的碱基数分别为23bp和 22bP。 358例T细胞淋巴瘤用TCRY通用引物(肠I一J1/2)扩增,PCR产物在 琼脂糖凝胶电泳和SSCP中的阳性病例分别为47和45例,最终阳性率 为77.6%;60例B细胞淋巴瘤用同样的方法检测,在琼脂糖电泳和 SScP中的阳性病例分别为22和6例,最终阳性率为10%;所有在琼 脂糖凝胶电泳中的阴性标本PCR产物在SSCP中全部为阴性。同SSCP 相比,琼脂糖凝胶电泳中总的假阳性率为巧.3%(l 8/1 18);PcR产物 直接测序所得序列不精确,无法判断基因的准确来源;克隆后测序则 可以准确得知重排基本基因的来源,6例PCR产物测序(每份测序 2一4个克隆)中有3例在其中发现有相同序列。TcRY基因重排在连接 区插入和删除的碱基数分别平均为7.2士2.7bP和9.3士5.sbP,v区基 因来源中VS占41.1%(7/17),V3占29.41%(5/17),V4占11.8% (2/17),vs占11.8%(2八7),v7(假基因)占5.9%(1/17)。在ssep 分析中,单链条带的数目是PCR产物中DNA克隆数的两倍。 4降落式PCR条件下,多重引物不影响其中单对引物的扩增效果。采 一2- 用多重引物PCR检测淋巴瘤基因重排,在65例T细胞淋巴瘤中,单 用第I家族的引物检测到的克隆性基因重排阳性率为80.0%,家族特 异性引物检测的阳性率为21.5%,去掉13.8%重复的阳性例数,T细 胞淋巴瘤的总阳性检出率为87.7%;70例B细胞淋巴瘤中Tc助基因 重排的检出率最终为10.0%。降落式PcR用于TcRp通用引物,T细 胞和B细胞淋巴瘤中阳性检出率分别为61.5%和7.1%。TCRp通用引物 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中未发现假阳性。 结论 1正交设计实验可用于PCR条件的优化;退火温度差别大的引物在降 落式PCR条件下仍可获得良好扩增效果。 ZJ切火at细胞基因重排与细胞免疫表型不一致,并且为双等位TcRY基 因重排,其中有假基因的重排,家族特异性基因重排在连接区碱基数 的变化较第I家族基因重排的明显。 3 Tc助通用引物扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中与在sscP分析中相比 有假阳性,但无假阴性,其中的假阳性可以在SSCP分析中排除;PCR 产物直接测序无法用于TC助基因重排的准确分析,但克隆后测序则 准确得知基因重排的相关基
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R733.1

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 崔峰,夏家辉;关于假基因的研究进展[J];生命科学研究;1999年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 章波,向渝梅,白云,许雪青,王燕;小鼠peroxiredoxin基因家族的生物信息学分析[J];第三军医大学学报;2005年09期
2 潘胜美;陈国安;;T细胞受体基因VγⅠ—Jγ重排检测在血液病中的临床意义[J];实验与检验医学;2008年03期
3 齐磊;刘国庆;;人类转录假基因序列碱基片段的分析研究[J];集宁师范学院学报;2012年04期
4 张正斌;基因学(Genics)——未来的新兴学科[J];世界科技研究与发展;2000年06期
5 汪萌;伍祚斌;李定琴;孙雪飘;张家明;;拟南芥芥子酶基因TGG6是花特异表达的假基因[J];生命科学研究;2007年04期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 赵岩;Ⅳ型分泌系统在高致病性2型猪链球菌引发链球菌中毒性休克综合征中作用的研究[D];第三军医大学;2011年
2 黄诚梅;甘蔗脯氨酸积累与△~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(ScP5CS)基因克隆及转化研究[D];广西大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙亮亮;TCR及IgH基因重排在T淋巴细胞浸润亲表皮疾病诊断中的意义[D];石河子大学;2010年
2 潘胜美;T细胞受体基因VγⅠ-Jγ重排检测在血液病中的临床意义[D];江西医学院;2004年
3 朱承刚;几种野生鼠4.5S基因的克隆和序列分析[D];曲阜师范大学;2006年
4 师丽敏;天牛科发育关系、基因条码构建及测序中假基因的研究[D];南京林业大学;2006年
5 杨旭冉;超抗原SEB致小鼠免疫抑制模型的建立及机制的初步研究[D];第三军医大学;2005年
6 孙哲;河南食管癌高发区人群SCCA1、Prx1表达与食管癌预后相关因素分析[D];郑州大学;2006年
7 徐艳艳;土槐消银方治疗进行期寻常型银屑病的临床观察及实验研究[D];南京中医药大学;2009年
8 单耀军;中国明对虾精细胞和精子核碱性蛋白种类及生化特性研究[D];河北大学;2007年
9 单耀军;内含子与基因间隔序列长度及基因表达量间关系的研究[D];河北大学;2007年
10 陈加利;番木瓜异硫氰酸苄酯含量测定及芥子酶基因时空表达的研究[D];海南大学;2010年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张晓飞,周韧,杨幼萍,毛峥嵘,杨水友,章锁江;非霍奇金淋巴瘤抗原受体基因重排检测中双重重排现象的初步研究[J];中华血液学杂志;2004年10期
2 罗书练;淋巴瘤对单克隆抗体出现意外的反应性(文摘)[J];细胞与分子免疫学杂志;1989年02期
3 黎军和;儿童滤泡性淋巴瘤临床病理学特征的分析[J];国外医学.内科学分册;2003年11期
4 郭宏强,张明智,王贵叶,范翠珍,范魁生;基因重排对淋巴细胞恶性增殖性疾病的诊断价值[J];中国误诊学杂志;2004年09期
5 洪锦心,朱伟民,陈渊卿,魏明辉,吴虹燕,潘瑞彭,张华忠,余新生;免疫球蛋白(Ig)基因重排在诊断人B淋巴细胞性恶性疾病中的应用研究[J];肿瘤;1988年06期
6 张爱梅;原发性骨淋巴瘤4例报告并文献复习[J];临床荟萃;2004年20期
7 武超,翟志敏;免疫球蛋白和T细胞受体基因重排的检测在淋巴造血系统肿瘤诊断中的应用[J];蚌埠医学院学报;2004年06期
8 韩慧霞,朱梅刚,张彦,耿舰,李贵春,韩西群;伴有明显淋巴滤泡的非特指外周T细胞淋巴瘤[J];中华血液学杂志;2004年10期
9 金亦,苏祖兰,李迎春,唐录英,郭少忠,冯智英;非霍奇金淋巴瘤IgH及TCRγ基因重排的意义[J];中华血液学杂志;2004年10期
10 陈云昭,李锋,胡文浩,李新霞,李洪安,蒋金芳;石蜡包埋B细胞性恶性淋巴瘤组织克隆性免疫球蛋白重链基因重排检测研究[J];肿瘤学杂志;2005年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 冯琦;孙凯;李红玲;苏明权;刘家云;张新海;张涛;王莎;王玮;孙秉中;;血清、血浆标本IgH基因重排对B细胞淋巴瘤的诊断价值[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
2 杨华;吕红波;王连有;;儿童非霍奇金淋巴瘤的免疫表型及BCL-2蛋白表达的临床意义[A];第十一届中国抗癌协会全国淋巴瘤学术大会教育论文集[C];2009年
3 施若非;赵肖庆;郑捷;;母细胞性NK细胞淋巴瘤——附二例报告[A];2010全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2010年
4 宋兰云;胡晓丽;赵林胜;宁培儒;;脾外周T细胞淋巴瘤,非特殊类型(巨块型)1例[A];中华医学会病理学分会2007年学术年会暨第九届全国病理大会论文汇编[C];2007年
5 秦伟;屈娅;张海涛;张春梅;;眼眶淋巴瘤的磁共振初步观察[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
6 张桂英;肖嵘;文海泉;陆前进;;原发性皮肤B细胞淋巴瘤1例报道[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年
7 陈志丰;张祥松;;原发性结节淋巴瘤~(18)F-FDG PET/CT影像学特点[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
8 方建培;黄绍良;黎阳;郭海霞;王潇娉;周敦华;陈纯;;利妥昔单抗联合自体外周血造血干细胞移植治疗儿童Burkitt淋巴瘤[A];第八届全国儿童肿瘤学术会议论文汇编[C];2009年
9 王宗武;张永宏;;胃粘膜相关组织淋巴瘤1例报道[A];2009年贵州省中西医结合消化系病学术交流暨专题学术讲座论文汇编[C];2009年
10 马寒;邵春奎;梁琼;苏祖兰;刘加军;陆春;;胃肠道症状首发伴有皮肤表现的血管内NK/T细胞淋巴瘤一例报告并文献复习[A];2011全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 沈悌 谢海燕 北京协和医院血液科;注意防范淋巴瘤的袭击[N];上海中医药报;2009年
2 主任医师 佟苪;预防淋巴瘤细节很重要[N];医药养生保健报;2009年
3 孙理 张长鑫 本报记者 赵琳;恶性淋巴瘤到底有多“恶”[N];哈尔滨日报;2009年
4 健康时报特约记者 胡颜 赵迎 陈锦屏 张长鑫;防淋巴瘤多吃碱性食物[N];健康时报;2009年
5 本报记者 于娟;专家教您了解淋巴瘤[N];中国医药报;2009年
6 指导专家 上海第二医科大学附属瑞金医院血液科主任 沈志祥 教授;淋巴瘤康复期 莫小视复诊[N];医药导报;2009年
7 中国医学科学院肿瘤医院副院长 石远凯 浙江大学医学院二附院血液内科主任 张晓红 北京垂杨柳医院中医科主任 赵兰才 北京市肿瘤医院肿瘤康复科主任 章新奇 湖湘中医肿瘤医院放疗科主任 巫爱华;早发现,战胜夺命淋巴瘤[N];中国中医药报;2009年
8 安阳地区医院副院长、主任医师 李新刚;从罗京去世谈淋巴瘤的防治[N];安阳日报;2009年
9 北京朝阳医院骨科副主任医师 康南;骨头上也会长淋巴瘤[N];保健时报;2009年
10 上海中医药大学教授 何裕民;淋巴瘤慎对首次治疗[N];健康时报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 韩西群;T细胞淋巴瘤TCRγ基因重排特征分析及检测方法的优化[D];第一军医大学;2004年
2 闵大六;中国人B细胞性非霍奇金淋巴瘤中BCL-6基因异常的研究[D];复旦大学;2004年
3 张永清;BCL-6与非霍奇金淋巴瘤的发生及白血病细胞K562分化和凋亡的关系[D];第四军医大学;2002年
4 卢建红;H9N2亚型AIV基因组序列分析及用反向遗传技术产生多个H9N2和H5重组流感病毒[D];扬州大学;2004年
5 孙文佶;外套细胞淋巴瘤bcl-1/IgH基因重排及其分子机理的研究[D];浙江大学;2001年
6 刘壮;癌基因MDM2和抑癌基因P53的表达与儿童非何杰金淋巴瘤关系的研究[D];广西医科大学;2002年
7 于锦香;淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤与人类疱疹病毒8的相关性研究[D];中国医科大学;2003年
8 水若鸿;套细胞淋巴瘤形态学、免疫表型和遗传学特征及其诊断价值的研究[D];复旦大学;2003年
9 王宏勤;原发性中枢神经系统淋巴瘤的临床病理、免疫表型和bcl-6基因重排研究[D];四川大学;2004年
10 曹阳;淋巴瘤血管内皮细胞异常表达Tim-3:一种新的肿瘤免疫逃避机制的探索研究[D];华中科技大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 施纯玫;非霍奇金氏淋巴瘤克隆性基因重排分子检测的临床意义[D];福建医科大学;2004年
2 王娟红;鼻NK/T细胞淋巴瘤瘤细胞属性及其亚型探讨[D];第四军医大学;2004年
3 柳刚;淋巴瘤免疫组化和基因诊断标准化的初步研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
4 于晓明;胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤20例临床分析[D];吉林大学;2004年
5 李辉;淋巴瘤HL和ALCL中c-IAP2与gas1的表达及其相关性研究[D];暨南大学;2002年
6 周泽平;免疫球蛋白kappa基因重排在B细胞增殖性疾病中的检测及其应用[D];昆明医学院;2004年
7 喻镁佳;As_2O_3抑制人淋巴瘤Raji细胞增殖及VEGF表达[D];昆明医学院;2005年
8 何金杰;原发性胃肠道恶性淋巴瘤36例临床病理分析[D];浙江大学;2008年
9 谭亚敏;高剂量化疗联合自体外周血造血干细胞移植治疗难治性、复发性恶性淋巴瘤[D];浙江大学;2005年
10 刘冬梅;利用组织芯片研究MALT型淋巴瘤中细胞周期与凋亡基因蛋白的表达及意义[D];山西医科大学;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026