姜黄素对胆盐诱导的急性胰腺炎防治作用的应用基础研究

【摘要】：急性胰腺炎为临床常见疾病，发病率逐年增加，因对急性胰腺炎发病中确切的分子机制尚不明确，目前缺乏及时有效的治疗。但近年研究证实：腺泡细胞接受刺激后可分泌大量的炎性因子并促进炎性细胞浸润，导致局部炎症反应，炎性介质在胰腺炎症及随后的全身炎症反应中起重要作用。而核转录因子-κB(NFκB)是炎性介质的上游调控因子，抑制NFκB的激活可成为预防或治疗急性胰腺炎的靶作用点。姜黄素是纯天然植物提取物，无毒副作用，能抑制细胞内NFκB的激活，但在临床常见的胆源性胰腺炎中，NFκB作用机制不明，且未见应用姜黄素防治胆源性胰腺炎的报告。本研究应用分子生物学的方法，对此进行系统研究，目的是在理论上进一步揭示NFκB在急性胰腺炎发病中的作用及机制；在应用上为姜黄素最终成为治疗急性胰腺炎的高效新药奠定基础。 一 急性胰腺炎动物模型制备及组织形态学研究 本实验参考Aho HJ等的方法，通过逆行性胰胆管注射1％或4％的牛磺胆酸钠，制备实验性大鼠急性胰腺炎。应用Aho的方法，予4％牛磺胆酸钠，制备急性出血坏死型胰腺炎模型(AHNP)；本实验经过改良，予1％牛磺胆酸钠，制备更接近人发病状态的水肿型胰腺炎(AEP)。观察大鼠AEP后0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h胰腺和肺组织大体形态变化和光镜下组织形态变化；观察大鼠AHNP1h、6h、72h胰腺和肺组织大体形态变化和光镜下组织形态变化。结果：AEP组胰腺组织间质增宽、渗出增多，小叶间间隔及腺泡间隔扩张，中性粒细胞及淋巴细胞浸润，但数量不均一，可见腺泡内空泡形成，偶可见腺泡细胞核固缩，血 管变化不明显。AEP组肺组织肺泡壁增厚及间质炎细胞浸润。AHNP组 胰腺组织可见范围大小不等的出血改变，腺泡坏死表现最为突出。胰腺 腺泡、间质均有明显充血水肿和炎性细胞浸润，腺泡渐次出现充血肿胀， 萎缩，出血，凝固性坏死，核固缩，核碎裂，核溶解等，腺泡坏死可呈 点状、片状或大片状，坏死程度随时间而逐渐加重，间质中大片脂肪坏 死。AHNP组大鼠肺组织肺泡壁增宽，肺泡壁破裂，有的融合成肺大泡， 肺间质充血、水肿、明显增宽，肺泡与肺间质中可见大量中性粒细胞浸 润，同时还出现代偿性肺气肿、肺淤血等变化。结论:逆行性胰胆管注 射胆盐诱导的大鼠急性水肿型胰腺炎和急性出血坏死型胰腺炎模型成功 建立，其致病因素与临床相似，可以模仿胰管梗阻、胆汁返流等病因形 成，适于进行急性胰腺炎发病机制的研究。 二核因子·沼激活在胆盐诱导的急性水肿型胰腺炎发病中作用及机制 的实验研究 目的:探讨核因子一沼(nuclear fact。卜k叩paB，NF仗B)在胆盐诱导的 急性水肿型胰腺炎(AEP)发病中的作用及机制。方法:108只雄性Wistar 大鼠随机分为正常对照组、Saline组、AEP组和NAC(N一乙酸半胧氨酸) 预处理组。A卫P模型采用l%牛磺胆酸钠50pl胰胆管内逆行性注射方法 建立，制模后在0.5h、lh、Zh、3h、 6h、gh、12h七个时相点分别处死 大鼠(各9只)。Sallne组胰胆管内注射等量生理盐水，在lh、2h、3h、 6h、9h、12h六个时相点分别处死大鼠(各3只)。NAC预处理组于建立 AEp模型前lh腹腔注射NAC(100m姚g)，分别于制模后lh、3h处死 大鼠(各9只)。动物处死后，心脏穿刺取血，留取胰腺和肺组织。于透 射电镜下观察胰腺组织细胞形态的变化。应用电泳迁移率改变分析 (EMSA)检测AEP胰腺组织N下仗B的DNA结合活性，并以免疫荧光 组织化学方法检测NF沼P65活化的细胞定位，以W匕sten blot和半定量 免疫荧光组织化学方法检测1火B一a和I忍一p蛋白表达变化，采用半定量 RT-PcR方法检测胰腺组织细胞因子TNF一a、IL一lp和IL一6，趋化因子Gro a和MCP一1以及炎性相关酶iNOS的mRNA表达水平，并以胰腺组织光 镜下病理观察、血清淀粉酶、胰腺组织含水量、MPO活性和胰蛋白酶活 5 性作为评价AEP严重程度的指标，以肺组织光镜下病理观察和MPO活 性作为评价肺损伤的指标。结果:(1) NF比的DNA结合活性在AEP 诱导后0.5h即明显激活，1h活性最高，Zh有所下降，3h活性又有升高， 3一12h活性维持在高于正常的水平，并且N下KBP65活化定位于胰腺腺泡 细胞核;胰腺ltB一a的表达在AEP诱发后lh明显减少，3h时即开始表 达增多，到6h时完全恢复至正常状态。而1仗B一p降解的发生要晚于 I沼一a，到12h尚未完全恢复正常。半定量免疫荧光组织化学方法检测 I沼一a和IKB一p蛋白表达与W七sten blot结果基本相符。(2) AEP诱发后 lh、Zh及6h后，IL一lp、IL一6、Groa和MCP一1 mRNA表达水平均可见 上调，其中以Groa和MCP一1表达上调最为显著(P0.05)，在AEP诱 发后1一Zh均表达升高约数十倍至百倍，而iNOSmRNA表达水平上调较 前者不明显且反应拖延，TNF一a在AEP诱发后几乎未见表达。胆管内逆 行性注射小剂量生理盐水后早期(lh)，也可见IL一lp、几一6、Gro。和 MCP一1 mRNA表达增加，但较对照组变化不显著(P0.05)。(3) AEP 严重程度评价:AEP大鼠胰腺组织含水量较对照组显著增加(P0.05)， 并呈现时间依赖性增加;血清淀粉酶轻度升高;MPO活性能反映组织中 中性粒细胞的数量，胰腺和