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《第一军医大学》 2004年
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聚乳酸-甲壳素接骨板的体外细胞毒性研究

李毅  
【摘要】:研究背景 目前临床广泛应用的金属骨折内固定材料,由于存在应力遮挡效应、腐蚀刺激周围组织、易感染等弊端,不利于骨折愈合,一般需二次手术取出;而可吸收性骨折内固定材料,主要以聚乳酸为代表,具有无应力遮挡效应、避免再次手术取出等优点,被认为是理想的骨折内固定材料。然而,随着研究和应用的进一步深入,聚乳酸作为骨折内固定材料的缺陷也进一步暴露:首先,聚乳酸降解时生成的乳酸等酸性降解产物,可使局部组织内的pH值下降,诱发迟发性异物炎性反应;其次,聚乳酸的体内降解周期过长,影响骨折愈合后的骨组织改建,也容易导致感染等,限制了聚乳酸的应用。 甲壳素是自然界中少见的带正电荷的高分子聚合物,与软骨基质糖氨多糖(GAG)结构相似。该材料具有良好的生物相容性,无毒,降解过程中产生的低分子寡聚糖在体内不积累,几乎没有免疫原性,对人体无不良反应,目前已应用于伤口敷料、骨缺损充填及药物缓释系统等生物医学领域,其医学应用研究十分活跃。但甲壳素在水及有机溶剂中不溶解,壳聚糖只溶于稀酸中,所以其应用范围受到限制。在甲壳素分子结构中含有很多活泼的氨基(-NH_2)和羟基(-OH),易于进行化学修饰和改性,如果引入多功能基团,还可拓宽其应用领域。 根据其生物学特性,我们研制了新型的骨折内固定材料——聚乳酸- 甲壳素接骨板(PL刀CHI)及螺钉。甲壳素降解时释放的氨基葡萄糖等 碱性小分子物质,可中和聚乳酸降解时释放出的乳酸等酸性产物,抑制 迟发性异物炎性反应的发生;甲壳素中轻基(一OH)、氨基(一HZ)等大 量活性基团,可与聚乳酸分子中的活性基团轻基(一OH)、梭基(一COOH) 通过氢键、酷键、氨键、离子键等多种形式结合,增强聚乳酸一甲壳素接 骨板的机械强度,满足骨折内固定的需要;另外,聚乳酸的降解过程, 是无需酶参与的简单水解过程,而甲壳素具有良好的亲水性,可加速水 分子扩散渗透进入聚乳酸一甲壳素接骨板内的速度,促进了聚乳酸降解, 缩短其体内降解吸收周期。二者相互促进、相互补充,因此,聚乳酸一甲 壳素接骨板具有良好的性能,有望成为一种具有良好发展前景的可吸收 骨折内固定材料。 研究目的 通过体外细胞培养技术,采用不同的细胞毒性试验方法,检测聚乳 酸一甲壳素接骨板接触细胞后细胞发生的特异性生物学变化,并预测最终 体内应用时的组织细胞反应,在短期内较经济、简便地检测出聚乳酸一甲 壳素接骨板的细胞毒性,为动物实验的进行与否提供先决条件,并为今 后聚乳酸一甲壳素接骨板的临床应用提供理论依据和实验基础。 研究方法 1.分别用聚乳酸一甲壳素接骨板浸提液(测试样品,实验组)、聚乳酸接 骨板浸提液(参照样品组)和即Mn 640培养基(空白对照组)培 养L929细胞,通过细胞增殖度法(RGR法)、细胞生长抑制法(MTT 法)、流式细胞仪法(F CM法),观察其生长、增殖及形态学变化, 对聚乳酸一甲壳素接骨板的细胞毒性进行评价; 2.将L929细胞直接接种于聚乳酸一甲壳素接骨板表面,进行直接接触 法实验,通过光镜、扫描电镜及透射电镜观察细胞的生长、增殖及 形态学变化,进一步对聚乳酸一甲壳素接骨板的细胞毒性进行评价。 3.用SD大鼠成骨细胞进行MTT法和直接接触法实验,观察细胞的生 一2一 长、增殖及形态学变化,评价聚乳酸一甲壳素接骨板的骨细胞相容性。 4.统计方法:采用SPsslo.0 forwindows统计软件,将所得实验数据进 行统计学处理。 结果 1.细胞增殖度法:用聚乳酸一甲壳素接骨板浸提液(实验组)培养的 L929细胞在第2、4、7d的细胞相对增殖率均在100%以上,细胞毒性评 分均为O级;各观察期中,实验组细胞呈短梭形,细胞突充分伸展,形 态良好,并可见大量分裂细胞,胞核未见异形性,而且随着时间延长, 细胞数量增多,与空白对照组相比,PO.05,无显著性差异,说明聚乳 酸一甲壳素接骨板浸提液对L929细胞的增殖有促进作用,无明显的细胞 毒性。 2.MTT法:随培养时间延长,聚乳酸一甲壳素接骨板的50%、100%浓 度浸提液组(实验组)和RPMI 1 640培养液组(空白对照组)的OD值 均逐渐增加,50%、100%浓度浸提液组在第2、4、7d的细胞相对增殖率 均在90%以上,聚乳酸一甲壳素接骨板的细胞毒性为0级或1级,提示聚 乳酸一甲壳素接骨板浸提液对L929细胞增殖无明显抑制作用,说明聚乳 酸一甲壳素接骨板无明显的细胞毒性。 3.流式细胞仪法:聚乳酸一甲壳素接骨板组(实验组)和聚乳酸接骨板 组(参照样品组)细胞的GOG;期(DNA合成前期)的DNA百分含量 低于空白对照组;在S期(DNA合成期),实验组(49.6%)高于参照样 品组(38.07%)和空白对照组(22.57%),提示聚乳酸一甲壳素接骨板能 促使更多的L929细胞进入S期,使DNA合成加速,导致细胞增殖,无明 显的细胞毒性。 4.直接接触法: 光镜下观察,聚乳酸一甲壳素接骨板组(实验组)可见大量 L929细 胞附着于聚乳酸一甲壳素接骨板表面生长,形态良好。细胞与聚乳酸一甲壳 素接骨板紧密贴合,并随着时间延长,大量增殖。与聚乳酸接骨板组(参 照样品
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R318.08

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