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《第一军医大学》 2004年
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兔骨髓基质细胞源性神经干细胞诱导分化及移植修复脊髓损伤实验研究

代广辉  
【摘要】:脊髓损伤是一种严重的伤病,其致残率与致死率非常高。对于脊髓损伤的传统治疗方法有脊柱骨折脱位的复位固定、解除脊髓压迫、对症及康复治疗。近年来,随着神经病理生理及神经发育学研究的不断深入,神经组织细胞移植逐渐应用于脊髓损伤的治疗并取得了肯定的效果。神经干细胞(Neural stem cellS,NSCs)特别是骨髓基质细胞源性神经干细胞分化调控和移植修复中枢神经系统功能损害亦成为研究重点。 骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)是骨髓细胞中除去造血干细胞之外的细胞部分,目前已证实骨髓基质细胞在特定的培养条件下可分化成多种细胞,如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞和神经元及神经胶质细胞等,具有克隆样增殖特性。其多潜能性的发现和向神经细胞方向定向分化的成功,为神经干细胞的来源增加了一个新的途径,也为解决“自体源神经干细胞”移植方案中细胞数量不足的问题提供了很好的思路。 本研究通过建立体外、体内实验模型等手段,对骨髓基质细胞源性神经干细胞的体外扩增、定向分化、移植及其所移植细胞在损伤脊髓内的存活情况等进行研究,以进一步了解骨髓基质细胞源性神经干细胞的生物学特性,并探讨其在神经系统疾病中的应用的可行性和有效性。 第一部分:兔骨髓基质细胞体外培养分化为神经干细胞的实验研究 一、目的: (一)、观察兔骨髓基质细胞在体外培养及诱导分化获得神经干细胞的可行性; (二)、探讨并确立骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的适当培养方法及条件,建立一个获得“骨髓源神经干细胞”的成熟技术平台,为其在 组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。 二、方法: (一)、以新西兰大白兔为实验对象,无菌穿刺实验动物骨髓腔抽取 骨髓,梯度密度离心获得有核细胞,粘附法提取骨髓基质细胞。 (二)、提取的骨髓基质细胞悬液加入神经干细胞培养液,调整细胞 浓度到1护个加1后,接种于多孔培养板中,加胎牛血清(1%终浓度)及 LIF(10ng/ml)+bFGF(10ng/ml),在37oC、5%C02、饱和湿度条件下培 养,48小时后换液以去除非粘附细胞,以后每周换液2次。培养l~2 周后得到较纯化的BMSCSS,可进行细胞传代培养,在培养过程中加入胎 牛血清以及RA(终浓度0.5 pg/m1)以诱导BMSCS向神经干细胞分化。 (三)、观察培养细胞:CKZ型倒置相差光学显微镜(0LY’MPAS,JAPAN) 追踪观察细胞生长情况并拍照;采用SABC法进行免疫细胞化学检测(一 抗分别为鼠抗一Nestin、鼠抗一NSE、鼠抗一GPAP,二抗试剂盒为生物素化 羊抗小鼠IgG/羊抗兔工gG,链霉亲和素一生物素一过氧化酶复合物),不 同阶段培养细胞经4%多聚甲醛固定,0.01mol/L PBS冲洗,一抗37℃60 min;生物素化二抗室温孵育10 min;链霉亲和素一生物素一过氧化酶复 合物室温孵育10 min;DAB显色染色5~15min,着棕色的细胞为阳性, OLYMPAS光学显微镜观察拍照。 三、结果: (一)、贴壁细胞培养48h后有分裂增殖,然后逐渐形成岛屿状细胞 克隆团,给予适当的分化条件10一20d后,这些细胞能分化成具有细长 突起、多种形态的细胞。 (二)、经免疫细胞化学鉴定,早期的培养细胞在没有给予诱导分化 时可阳性表达Nestin,表明具有干细胞特性;培养细胞经诱导分化后有 NSE阳性表达的细胞出现。 四、结论: (一)、新西兰大白兔骨髓的BMSCS在合适的体外培养条件下能够转 化为神经干细胞,保持增殖分化能力; (二)、本实验室采用的培养方案(神经干细胞培养基)适合于大白 兔骨髓基质细胞向神经干细胞转化; (三)、源自BMSCSs的神经干细胞能分化出具有神经系细胞特征的 一3- 细胞; 第二部分:兔骨髓源神经干细胞自体移植修复脊髓损伤的实验研究 一、目的: (一)、建立脊髓损伤动物模型后,将源自自体的“骨髓基质细胞源 性神经干细胞”经标记后移植到模型动物脊髓损伤部位,观察其增殖、 生长和迁移等情况; (二)通过采用伤后不同时间移植“骨髓基质细胞源神经干细胞” 的方法,观察骨髓源神经干细胞于创伤不同时期在创伤灶的生长、存活 情况,探讨神经干细胞移植修复脊髓损伤的最佳时机。 二、实验分组: 随机将动物分为九组: 【移植治疗组11脊髓全横断损伤十神经千细胞及胶原基质蛋白移植组, 于脊髓损伤立即移植。(10只); 【移植治疗组2】脊髓全横断损伤十神经干细胞及胶原基质蛋白移植组, 于脊髓损伤IW移植。(10只); 【移植治疗组3】脊髓全横断损伤十神经干细胞及胶原基质蛋白移植组, 于脊髓损伤ZW移植。(10只); 【移植治疗组4】脊髓全横断损伤十神经干细胞及胶原基质蛋白移植组, 于脊髓损伤3W移植。(10只); 【移植治疗组5】脊髓全横断损伤十神经干细胞及胶原基质蛋白移植组, 于脊髓损伤4W移植。(10只); 【移植对照组1]脊髓全横断损伤+神经干细胞移植组,于脊髓损伤2w 移植。(10只); 【移植对照组2】脊髓全横断损伤+胶原基质蛋白移植组,于脊髓损伤2w 移植。(10只); 【手术对照组】脊髓全
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R651.2

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【参考文献】
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