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晚期糖基化终产物诱导内皮细胞通透性增高的作用机制

郭晓华  
【摘要】:实验目的:本课题以人脐静脉内皮细胞株ECV304及原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为对象,应用细胞培养、细胞免疫组化、单层内皮细胞通透性的测定等方法观察不同浓度和不同作用时间的晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对内皮细胞骨架形态和功能的影响。通过上述研究试图阐明AGEs对血管内皮细胞的影响以及可能的信号转导通路,为进一步阐明与AGEs相关的动脉硬化及糖尿病血管并发症等多种心血管疾病的发生机制提供实验依据,并为其防治提供新的思路和有效手段。 实验方法:AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-modified human serum albumin AGE-HSA),由人血清白蛋白与葡萄糖共孵育6周制得。内皮细胞分别接种于微孔小皿(petri dish)和铺有1%明胶的双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5mm,孔径大小0.4μm),待细胞长至融合后,换无血清培养基使细胞获得同步生长。用不同浓度的AGEs与人内皮细胞在体外共同培养不同时间,并设立HSA阴性对照组进行比较。在各实验分组中,分别利用可溶性RAGE的抗体(anti-RAGE IgG)、NADPH氧化酶抑制剂(Apocynin)、ERK通路抑制剂PD98059、p38抑制剂SB203580及JNK通路抑制剂SP600125,预处理内皮细胞;另外,利用重组腺病毒MEK1,MKK6b,p38α,MKK7的无活性型突变体预转染内皮细胞,均继以AGEs再孵育8h。采用荧光染色法观察细胞骨架蛋白的形态学改变,罗丹明—鬼笔环肽(Rhodamine-phalloidin)或FITC—鬼笔环肽(FITC-phalloidin)示F-actin,俄勒冈绿标记的G-actin特异性结合物DNA酶I(Oregon Green-DNase I)示G-actin;TRITC荧光标记白蛋白漏出法测定单层内


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