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《第一军医大学》 2006年
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葛根芩连汤有效部位制剂的标准化研究

谭晓梅  
【摘要】:葛根芩连汤出自《伤寒论·太阳篇》,为医圣张仲景名方,有解表清里,升清止利之功效,主要用于治疗“协热下利”证。方中重用葛根为君,既可解肌表之热,又能升发脾胃清阳之气而止利;黄芩、黄连为臣,性味苦寒,善清里热,厚肠胃而治利;甘草甘缓和中,并协调诸药为佐使,四药配伍,共成清热解肌之剂。经数千年临床应用,疗效卓越。现代研究亦证实,该方对轮状病毒及细菌性感染性腹泻疗效确切,而西药主要是对症治疗无特异性抗轮状病毒及感染肠炎的有效药物。中药在抗病毒方面有一定的优势,葛根芩连制剂对菌痢、急性肠炎及小儿病毒性腹泻等有良好疗效,退热、止泻作用优于常规治疗,病程只需三天,在使用过程中,未见其产生耐药性。目前该方制剂有葛根芩连片、微丸、胶囊、口服液等,其中葛根芩连片及葛根芩连微丸两种制剂均为八十年代批准的新药,各版药典均予与收载,在提取工艺上两种制剂有所差异,但功能主治一致,葛根芩连片无定量指标,微丸只有葛根素含量测定,工艺、质量标准都有待于进一步提高。 有效部位制剂是从复方中药中提取的拥有共同母核或共同化学性质的一类活性成分物质群组成的制剂,因此它不仅能较好地体现中医中药的多成分、多靶点的优势和特色,而且通过对有效部位的提取纯化,剔除了大量的不必要成分,使化学成分更加清楚、药品质量标准的制订和生产质量的控制更具有针对性、药品质量稳定可控、作用具有专一性、主要药效作用更加突出。由于科技含量大大提高,增加了药品安全性、有效性和质量的可控制性,使其更易于同国际标准接轨,增强国际竞争能力,推动中医药走向世界。因此开展葛根芩连方的有效部位新制剂的现代研究非常必要。 本研究以葛根芩连汤为质量和药效研究依据,结合国内关于有效部位制剂的技术要求,吸收国际上对植物药研究及质量控制方法,采用系统、全面的质量控制方法,开展葛根芩连汤有效部位新制剂的研究,做到质量控制方法科学、合理、可行;制剂研究以主要成分的溶出度及生物利用度评价制剂工艺,希冀为中药复方制剂的现代研究探索新的模式。 本项目研究内容包括:制剂药材质量的研究、汤剂中主要有效成分及主要有效部位质量控制的研究、有效部位提取精制工艺的研究、有效部位成分分析研究、有效部位与汤剂中成分谱的HPCE对比研究、制剂成型工艺研究、制剂质量标准研究、稳定性试验、制剂中君药主要有效成分葛根素生物利用度研究等。 1.葛根芩连汤各味药材基原鉴定及质量控制标准 药材的质量与其所含的有效成分或指标成分相关,虽然成分复杂,但大多数成分之间的比例保持在一定的范围。在保证其种属、基原的情况下,测定其中一个或几个有效成分或指标成分含量,可以确定其质量。本项研究为有效部位新制剂研究,要求质量标准中对各有效成分规定上下限,因此为了保证制剂的均一性及质量稳定性,对制剂研究用的四味药材进行了质量监控,以确定研究及生产用药材的质量,同时为工艺研究,提供对比数据。采用HPLC法,测定葛根中的葛根素、黄芩中的黄芩苷、黄连中的盐酸小檗碱、甘草中甘草酸的含量。确定入药的葛根中葛根素含量为3.5%—5.0%、黄芩中黄芩苷含量为14.5—18.0%、黄连中小檗碱含量为8.5—11.0%、甘草中甘草酸含量为2.0%—2.5%。 2.汤剂中主要有效成分及有效部位的含量研究 本研究本着从有效汤剂出发,对汤剂中四味药物中主要有效成分葛根素、黄芩苷、小檗碱、甘草酸及三个主要有效部位进行了含量测定,以确定新制剂中主要有效部位及有效成分的含量,同时指导有效部位的提取、精制及制剂工艺的研究。 采用HPLC法,测定汤剂中葛根素含量为0.35g/剂;黄芩苷含量为0.53g/剂;小檗碱含量0.23g/剂;甘草酸含量为0.08g/剂。建立了汤剂中总生物碱含量测定方法:采用氧化铝柱分离出总生物碱,紫外分光光度法测定;建立了汤剂中总异黄酮含量测定方法:在分离生物碱的氧化铝柱上,用正丁醇洗脱异黄酮类成分,用紫外分光光度法测定;建立了汤剂中黄酮类成分测定方法:采用差示紫外分光光度法,使黄芩黄酮在适当的条件下,紫外吸收发生位移,而异黄酮等其他成分不发生位移,排除干扰成分的方法;经测定汤剂中总异黄酮含量为0.55 g/剂;总黄酮含量为1.12g/剂;总生物碱含量为0.50 g/剂。 3.有效部位提取精制工艺的研究 3.1葛根总黄酮提取工艺的研究:葛根总异黄酮为葛根的有效部位,因此对其进行了提取及精制工艺的研究。以95%乙醇作为提取溶剂,采用正交设计,考察提取时间、提取次数、溶剂体积对葛根素提取效果的影响。优化条件:葛根药材,加10倍量95%乙醇,提取1次,再加8倍量95%乙醇提取1次,每次3小时。 3.2葛根总异黄酮精制工艺的研究:葛根醇提取物中葛根异黄酮含量约为37%,含量较低。根据异黄酮成分的性质,采用混合溶剂并酸沉淀法来精制葛根醇提物。优化后的制备方法:葛根乙醇提取物粉末,加10倍量95%乙醇溶解,加醋酸水溶液调pH为2—3,静置30min,每次加乙酸乙酯25倍量萃取两次,合并乙酸乙酯萃取液,减压除去溶剂,得浸膏,干燥,即得。测得精制后的提取物总异黄酮平均含量为53.30%,转移率为94.56%。 3.3黄芩、黄连、甘草有效部位的提取工艺:葛根芩连汤方剂中另三味药黄芩、黄连、甘草为常用配伍,三味药配伍煎煮均相互影响彼此主要成分的含量,为了保持成分间的比例,本研究拟将三药合煎后,再精制其中的有效部位。有效部位包括黄芩中总黄酮和黄连中的总生物碱及甘草中少量黄酮和皂苷。以黄连中的小檗碱、黄芩中的黄芩苷为检测指标,采用正交设计评价提取工艺。优化提取工艺条件:三味药材用12倍水,提取2次,每次1小时。 3.4黄芩、黄连、甘草有效部位的精制工艺:本研究根据总黄酮和总生物碱的的性质,将水煎煮液,调至pH酸性,使几类成分溶解度下降,析出沉淀,进行精制。以黄连中的小檗碱、黄芩中的黄芩苷为检测指标,采用正交设计评价精制工艺。优化结果:水煎液浓缩为原液体积的1/7,调溶液pH为1—2,60℃水浴保温1小时,静置24小时。按最佳提取、精制工艺制备,总黄酮平均含量35.26%,总生物碱含量15.32%,提取物中两类有效部位含量之和为50.58%。 4.有效部位成分分析研究 4.1葛根异黄酮中化学成分的分析研究:取葛根异黄酮提取物,采用HPLC法,色谱柱:Zorbax S_B-C_(18)柱(250×4.6mm,5μm);流速:0.6ml/min;柱温:室温;检测波长:200—400nm。检测时间120min,流动相:甲醇—乙腈—水,梯度洗脱。对分离的各峰,进行DAD检测。经梯度洗脱,共分离出含量较高的10个异黄酮化合物,紫外吸收行为基本一致,并在250nm左右处有最大吸收,说明葛根提取物中,以异黄酮类物质为主,葛根素含量在总异黄酮中含量最高,面积归一化法测定,为42.2%。 4.2黄芩黄酮中化学成分的分析研究:取黄芩、黄连、甘草提取物,采用HPLC法,色谱柱:Zorbax S_B-C_(18)柱(250×4.6mm,5μm);流速:0.6ml/min;柱温:室温;检测波长:200—400nm。检测时间120min,流动相:甲醇—0.2%磷酸—水,梯度洗脱,对分离的各色谱峰,进行DAD检测,以黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品对照,考察各峰紫外吸收行为。由阴性图谱可见,在此洗脱条件下,样品中没有黄芩黄酮类成分的特征吸收,有生物碱、葛根异黄酮、甘草黄酮的特征吸收。同样洗脱条件下,样品液中有9个黄芩黄酮类成分的特征吸收,在275nm附近有最大吸收,其中包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素。黄芩黄酮中黄芩苷含量最高,面积归一化法测定,黄芩苷含量为总黄酮的56.4%。 4.3总生物碱中化学成分的分析研究:取经氧化铝柱洗脱的总生物碱溶液,采用HPLC法,色谱柱:Zorbax S_B-C_(18)柱(250×4.6mm,5μm);流速:0.6ml/min;柱温:室温;检测波长:200—400nm。检测时间120min;流动相:(0.01mol/LKH_2PO_4+0.2%三乙胺)—乙腈—甲醇,梯度洗脱。对分离的各峰,进行DAD检测。总生物碱样品,经梯度洗脱,共分离出含量较高的5个生物碱化合物,紫外吸收行为基本一致,并在350nm、265nm左右处有最大吸收,说明总生物碱提取物中,以异喹林类生物碱物质为主,小檗碱含量在总生物碱中含量最高、巴马丁次之。面积归一化法测定,小檗碱含量占生物碱总面积的63.4%。 5.总有效部位与汤剂中成分的HPCE对比分析研究 为了验证重组有效部位原料的合理性,考察总有效部位的各类成分谱与汤剂主要成分谱的相关性,本研究采用HPCE技术建立指纹图谱,对指纹图谱中各种参数进行对比研究。通过葛根、黄芩、黄连、甘草药材及全方和有效部位制剂的毛细管图谱的比较,对方剂及有效部位中的各峰进行归属,实现了一个条件下,一张图谱,方剂中各类成分的比较。比较结果显示,有效部位与汤剂中的主要色谱峰的出峰时间及出峰个数基本一致,主要峰面积之比在0.80—1.25之间,但3、6、7号峰黄芩成分的峰,它们在汤剂与胶囊中的面积之比为0.28—0.59,主要由提取及精制工艺引起。 6.制剂成型工艺研究 本研究按汤剂中的比例组成总有效部位原料,拟制成速效胶囊剂,进行了制剂成型相关工艺研究。由于葛根异黄酮、黄芩黄酮、生物碱等成分在水中溶解度较差,因此,采用以君药葛根素溶出度试验对L-HPC、交联CMC-Na、CMS—Na、交联PVP四种高性能崩解剂进行崩解、释放效果考察,根据威布尔分布计算各处方的Td,综合考虑,交联PVP对主要有效成分葛根素的溶出效果最好,在5min、10min、30min溶出率分别达到40%、80%、85%以上。 7.制剂质量标准研究 7.1制剂的定性研究:对制剂中所含四味药材进行TLC定性鉴别,采用对照品及对照药材对照,药材中主要特征成分与制剂中的相对应,方法专属性强。 7.2制剂中总有效部位及各有效成分含量测定方法研究:建立了三个有效部位含量测定方法,在排除杂质干扰后,采用紫外分光光度法测定,方法学考察结果表明,三种方法的精密度、重现性以及稳定性均良好,制剂中异黄酮含量为18mg/粒,总黄酮含量37mg/粒,总生物碱含量16mg/粒。采用HPLC建立了四个有效成分含量测定方法,方法学考察结果表明,精密度、重现性、稳定性均符合要求。制剂中葛根素含量10mg/粒,黄芩苷含量30mg/粒,小檗碱含量6mg/粒,甘草酸含量2.4mg/粒。 7.3葛根素溶出速率的制定:对方中君药葛根的有效成分葛根素制定了溶出速率的限定,初步规定胶囊中葛根素的溶出度10min,不得少于40%;30min,不得少于80%,从而保证了有效成分的溶出及吸收。 8.制剂加速稳定性试验 按中国药典2000版附录药物稳定性试验原则进行,取上市包装(铝塑袋)样品在温度为40℃、相对湿度为RH75%的条件下放置6个月,于1,2,3和6个月取样测定含量、溶出度,并与0月结果比较。结果表明,3批样品的含量及溶出率与0月相比,没有显著性差异,表明该制剂稳定。 9.制剂中君药主要有效成分葛根素生物利用度研究 采用HPLC法测定葛根素比格犬体内药动学过程。试验结果表明葛根素在犬体内呈二房室模型;汤剂中葛根素的Cmax及AUC均高于胶囊组,汤剂的Tmax为25.1min,胶囊的Tmax为54.4min,说明汤剂体内吸收快,且达峰浓度高,吸收较完全;胶囊进入体内后,存在崩解及溶出过程,吸收较慢,达峰浓度及生物利用度均低于汤剂。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R286

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10 王剑;郎轶咏;朱晓红;李忠林;王强;;三黄颗粒质量标准研究[A];2010年度全国医药学术论文交流会暨临床药学与药学服务研究进展培训班论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前5条
1 承德市农业信息站 宋煜敏 姜振侠 陈浩文 董翠萍 承德双滦区农牧局 邓少丰;种中药材做好这几点[N];河北科技报;2006年
2 韩富斌;“五大商药”扮靓商洛中药产业[N];陕西日报;2008年
3 陈 亮;陇西家种药材品种市场走势[N];中国中医药报;2005年
4 高山林;提高我国中药材质量的实践[N];中国中医药报;2004年
5 李禾;灯盏花可保护视网膜神经细胞[N];中国医药报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 李必波;黄芩苷-PVP共沉淀物胶囊的制备及犬体内药动学研究[D];重庆医科大学;2012年
2 史亚军;黄芩有效部位鼻用脑靶向制剂研究[D];成都中医药大学;2012年
3 许润春;黄芩苷磷脂复合物经鼻给药脑内递药特性的研究[D];成都中医药大学;2009年
4 杨全;甘草黄芩种内变异及选种基础研究[D];北京中医药大学;2007年
5 李化;黄芩采收规律及其数学模型的研究[D];中国中医科学院;2008年
6 张陆军;黄芩中黄芩苷在脑核团内的分布规律及其对脑功能的影响[D];清华大学;2005年
7 宋旦哥;基于不同来源的黄芩物质基础与其药效学相关性研究[D];北京中医药大学;2010年
8 梁新丽;白芷提取物对葛根、黄芩、川芎中活性成分生物药剂学性质—膜透过性的影响及机理研究[D];成都中医药大学;2013年
9 童荣生;半夏泻心汤配伍原理研究[D];成都中医药大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李升林;黄芩苷的提取与分离技术比较及其含量分析[D];齐齐哈尔大学;2012年
2 王建超;黄芩苷的提取及其对猪鸡几种常见病毒的体外作用效果试验[D];河南农业大学;2010年
3 申去非;黄芩苷液体栓的制备与体内外评价[D];天津大学;2011年
4 张兴潜;黄芩中黄芩苷的提取纯化工艺及其抗氧化研究[D];兰州理工大学;2012年
5 李静;黄芩苷的提取与纯化方法的研究[D];山东大学;2011年
6 沈蒙;注射用黄芩苷原料的质量标准研究[D];北京中医药大学;2014年
7 雷燕妮;黄芩中黄芩苷提取分离工业化生产工艺研究[D];西北大学;2012年
8 司磊;人肠道菌对黄芩苷的生物转化[D];西安工程大学;2012年
9 李振华;黄芩苷对全脑缺血/再灌注大鼠内源性神经干细胞增殖的影响[D];重庆医科大学;2011年
10 胡国强;黄芩栽培化学控制技术的研究及黄芩苷生物合成基因的克隆[D];北京中医药大学;2012年
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