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《第一军医大学》 2007年
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脂质体介导NF-κB decoy ODN对大鼠重症急性胰腺炎的影响

钟荣德  
【摘要】:【目的】: 通过在重症急性胰腺炎Sprague Dawley(SD)大鼠体内转染人工合成与NF-κB结合位点(5′-GGG ACT TTC C-3′)具高度亲和力的诱捕物寡核苷酸(decoy ODN)了解以下情况:1、诱捕物寡核苷酸在重症急性胰腺炎大鼠体内的转染情况;2、诱捕物寡核苷酸对NF-κB活性的抑制效果;3、诱捕物寡核苷酸对NF-κB活性的抑制后下游炎症因子、粘附因子mRNA的表达情况;4、诱捕物寡核苷酸对NF-κB活性的抑制后对重症急性胰腺炎大鼠肺、肝脏和胰腺早期损伤的影响。 【方法】: 1.脂质体介导NF-κB decoy ODN在重症急性胰腺炎大鼠肺、肝和胰腺的转染和分布: 1.1以5%牛磺胆酸钠制作重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型。 1.2 Sprague Dawley(SD)大鼠分组如下:假手术对照组为开腹翻动胰腺,未作任何处理组(n=20);裸ODN 1h组(n=10)和4h组(n=10);生理盐水1h组(n=10)和4h组(n=10);脂质体/错配ODN复合物1h组(n=10)和4h组(n=10);脂质体/decoy ODN复合物1h组(n=10)和4h组(n=10)。脂质体/ODN复合物或裸ODN 10μl/g,生理盐水1ml,分别于SAP模型建立后1h和4h经尾静脉注射,全部ODN 5′端行异硫氰酸荧光素(FITC)标志即FITC-ODN。各组均在注射4h后用断头法处死大鼠,立刻切取胰腺、肝脏、肺脏组织标本,并置于液氮中保存。 1.3胰腺、肝脏、肺脏组织冰冻切片后于荧光显微镜下观察FITC-ODN荧光和DAPI荧光并计算转染率。1.4电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测胰腺、肝脏、肺脏组织的NF-κB活性。 1.5电泳迁移率变动分析法检测NF-κB诱捕物双链寡聚脱氧核苷酸和NF-κB特异探针分别与NF-κB结合情况比较。 试验分组如下:第一组阴性对照组不加任何核蛋白提取物(n=10);第二组反应系为核蛋白提取物加生理盐水(n=10);第三组反应系为核蛋白提取物加100倍特异性标记的NF-κB探针(n=10);第四组反应系为核蛋白提取物加100倍非特异性未标记的SP1探针(n=10);第五组反应系为核蛋白提取物加decoy ODN(n=10);第六组反应系为核蛋白提取物加错配ODN(n=10)。所有核蛋白提取物均从生理盐水组提取。 2.脂质体介导NF-κB decoy ODN对重症急性胰腺炎大鼠肺、肝和胰腺炎症因子mRNA表达和早期器官损伤的影响 2.1以5%牛磺胆酸钠制作重症急性胰腺炎大鼠模型。 2.2 Sprague Dawley(SD)大鼠分组如下:假手术对照组为开腹翻动胰腺,未作任何处理组(n=10);裸ODN组(n=10);生理盐水组(n=10);脂质体/错配ODN复合物组(n=10);脂质体/decoy ODN复合物组(n=10)。脂质体/ODN复合物或裸ODN 10μl/g,生理盐水1ml,分别于SAP模型建立后1h经尾静脉注射。各组均在注射4h后,经腹主动脉抽取血样本进行血气分析(PO2)、淀粉酶检测,下腔静脉抽取血样本进行ALT和AST检测,以上生化检查由南方医院检验科检测;用断头法处死大鼠,立刻切取胰腺、肝脏、肺脏组织标本,并置于液氮中保存;另取大鼠肺、胰腺组织标本,进行肺、胰腺组织湿/干重比值测定;另取肺、胰腺组织标本,进行肺、胰腺组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定。 2.3电泳迁移率变动分析法检测胰腺、肝脏、肺脏组织的NF-κB活性。 2.4电泳迁移率变动分析法检测NF-κB诱捕物双链寡聚脱氧核苷酸和NF-κB特异探针分别与NF-κB结合情况比较。κ试验分组如下:第一组阴性对照组不加任何核蛋白提取物(n=10);第二组反应系为核蛋白提取物加生理盐水(n=10);第三组反应系为核蛋白提取物加100倍特异性标记的NF-κB探针(n=10);第四组反应系为核蛋白提取物加100倍非特异性未标记的SP1探针(n=10);第五组反应系为核蛋白提取物加decoy ODN(n=10);第六组反应系为核蛋白提取物加错配ODN(n=10)。所有核蛋白提取物均从生理盐水组提取。 2.5 RT-PCR检测胰腺、肝脏、肺脏组织中IL-1α、IL-2、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1 mRNA的变化。 【结果】: 1.1胰腺、肝脏、肺脏组织冰冻切片在荧光显微镜下观察裸ODN组细胞核可见少量散在的FITC-ODN荧光颗粒,荧光呈绿色,从荧光显微镜观察上述三个器官分布无明显差别;DAPI荧光颗粒则比较密集,荧光呈蓝色,从荧光显微镜观察上述三个器官均无明显差别,细胞质均极少见FITC-ODN荧光颗粒和DAPI荧光颗粒。脂质体/decoy ODN复合物组胰腺、肝脏、肺脏组织细胞核内可见较为密集的FITC-ODN荧光颗粒,荧光呈绿色,从荧光显微镜观察肺脏比肝脏密集,胰腺荧光颗粒分布相对稀疏;细胞核DAPI荧光颗粒均比较密集,荧光呈蓝色,从荧光显微镜观察上述三个器官无明显区别,细胞质均极少见FITC-ODN荧光颗粒和DAPI荧光颗粒。脂质体/错配ODN复合物组胰腺、肝脏、肺脏组织细胞质均可见大量密集的FITC-ODN荧光颗粒,细胞核内极少见FITC-ODN荧光颗粒;细胞核DAPI荧光颗粒均比较密集,荧光呈蓝色,从荧光显微镜观察上述三个器官无明显区别,细胞质均极少见DAPI荧光颗粒;生理盐水组和对照组未进行转染FITC-ODN和DAPI染色所以无荧光颗粒。 1.2裸ODN组1h与4h FITC-ODN转染率比较,脂质体/decoy ODN复合物组1h与4h FITC-ODN转染率比较,无显著性差异(P>0.05);裸ODN组FITC-ODN在体内肺、肝、胰腺器官的分布无显著性差异(P>0.05);脂质体/decoyODN复合物组FITC-ODN在肺部的表达较好,肝脏次之,胰腺较差,三者相互之间的差异有显著性(P<0.05)。脂质体/decoy ODN复合物组FITC-ODN转染率显著比裸ODN组高(P<0.05)。脂质体/错配ODN复合物组FITC-ODN不在细胞核表达,生理盐水组、假手术对照组未进行转染FITC-ODN所以无转染率。 1.3 EMSA结果显示脂质体/decoy ODN复合物组胰腺、肝脏、肺脏NF-κB活性受到明显抑制,与生理盐水组和脂质体/错配ODN复合物组比较有显著性差异(P<0.05),与未诱导SAP的假手术对照组比较也有显著性差异(P<0.05)。脂质体/decoy ODN复合物组1h与4h NF-κB活性比较无显著性差异(P>0.05)。裸ODN组NF-κB活性未见显著抑制,与脂质体/错配ODN复合物组、生理盐水组NF-κB活性比较无显著性差异(P>0.05),裸ODN组1h与4h NF-κB活性无显著性差异(P>0.05)。 1.4 NF-κB特异性探针与NF-κB结合后,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性显著被抑制,与非特异性SP1探针与NF-κB结合相比有显著性差异(P<0.05);非特异性SP1探针与NF-κB结合后,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性被抑制不明显。decoy ODN与NF-κB结合后,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性也显著被抑制,与错配ODN与NF-κB结合相比有显著性差异(P<0.05);错配ODN与NF-κB结合后,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性被抑制不显著(P>0.05)。decoy ODN与NF-κB结合和NF-κB特异性探针与NF-κB结合相比较,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性抑制无显著性差异(P>0.05);错配ODN与非特异性SP1探针和NF-κB结合相比较,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性抑制也无显著性差异(P>0.05)。 2.1.1脂质体/decoy ODN复合物组血气分析P02有显著的改善,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组相比有显著性差异(P<0.05),与假手术对照组相比无显著性差异(P>0.05)。脂质体/decoy ODN复合物组肺组织水肿程度和MPO活性有所下降,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组比较下降显著,均有显著性差异(P<0.05);与未诱导SAP的假手术对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)。裸ODN组血气分析、肺组织湿/干重比值和MPO活性与生理盐水组和脂质体/错配ODN复合物组相比均无明显改善,无显著性差异(P>0.05)。 2.1.2脂质体/decoy ODN复合物组血ALT与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组有显著性差异(P<0.05),与未诱导SAP的假手术对照组相比无显著性差异)P>0.05);AST与假手术对照组、生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组均有显著性差异(P<0.05)。裸ODN组ALT和AST与生理盐水组和脂质体/错配ODN复合物组相比无显著性差异(P>0.05)。 2.1.3脂质体/decoy ODN复合物组淀粉酶、胰腺组织湿/干重比值和MPO活性与假手术对照组、生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组比较均有显著性差异(P<0.05)。裸ODN组淀粉酶、胰腺组织湿/干重比值和MPO活性与生理盐水组和脂质体/错配ODN复合物组相比无显著性差异)P>0.05)。 2.2 EMSA结果提示脂质体/decoy ODN复合物组胰腺、肝脏、肺脏NF-κB活性受到显著抑制,与未诱导SAP的假手术对照组比较活性依然较高,差异有显著性(P<0.05)。生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组胰腺、肝脏、肺脏NF-κB活性减弱不显著,裸ODN组胰腺、肝脏、肺脏NF-κB活性与生理盐水组和脂质体/错配ODN复合物组比较差异无显著性(P>0.05)。 2.3 NF-κB特异性探针与NF-κB结合后,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性也是显著被抑制,与非特异性SP1探针与NF-κB结合相比差异有显著性(P<0.05);非特异性SPl探针与NF-κB结合后,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性被抑制不显著。decoy ODN与NF-κB结合后,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性显著被抑制,与错配ODN与NF-κB结合相比有显著性差异(P<0.05);错配ODN与NF-κB结合后,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性被抑制不显著。decoyODN与NF-κB结合和NF-κB特异性探针与NF-κB结合相比较,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性抑制无显著性差异(P>0.05);错配ODN与非特异性SP1探针和NF-κB结合相比较,NF-κB与核蛋白DNA的结合活性抑制也无显著性差异(P>0.05)。 2.4.1脂质体/decoy ODN复合物组TNF-α、ICAM-1m RNA的表达均显著下降,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P<0.05),与未诱导SAP的假手术对照组相比有显著性差异(P<0.05);VCAM-1m RNA的表达也显著下降,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P<0.05),与假手术对照组相比无显著性差异(P>0.05)。裸ODN组ICAM-1、IL-1α、IL-2、TNF-α、VCAM-1 mRNA的表达水平均较高,与生理盐水组和脂质体/错配ODN复合物组相比无显著性差异(P>0.05)。脂质体/decoy ODN复合物组IL-1α表达上升显著,上升水平与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组相比有显著性差异(P<0.05),与假手术对照组相比有显著性差异(P<0.05)。脂质体/decoy ODN复合物组IL-2表达也上升,与假手术对照组相比无显著性差异(P>0.05)。 2.4.2肝脏各个炎症因子的mRNA变化情况与肺脏情况相同。脂质体/decoyODN复合物组TNF-α、ICAM-1 mRNA的表达均显著下降,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P<0.05),与未诱导SAP的假手术对照组相比有显著性差异(P<0.05);VCAM-1 mRNA的表达也显著下降,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P<0.05),与假手术对照组相比无显著性差异(P>0.05)。裸ODN组ICAM-1、IL-1α、IL-2、TNF-α、VCAM-1 mRNA的表达水平均较高,与生理盐水组和脂质体/错配ODN复合物组相比差异无显著性(P>0.05)。脂质体/decoyODN复合物组IL-1α表达上升显著,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组相比有显著性差异(P<0.05),与假手术对照组相比有显著性差异(P<0.05)。脂质体/decoy ODN复合物组IL-2表达也上升,与假手术对照组相比无显著性差异(P>0.05)。 2.4.3脂质体/decoy ODN复合物组TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达均显著下降,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组比较有显著性差异(P<0.05),与未诱导SAP的假手术对照组相比有显著性差异(P<0.05)。裸ODN组ICAM-1、IL-1α、IL-2、TNF-α、VCAM-1 mRNA的表达与生理盐水组和脂质体/错配ODN复合物组相比无显著性差异(P>0.05)。脂质体/decoy ODN复合物组IL-1α和IL-2表达上升显著,与生理盐水组、脂质体/错配ODN复合物组和裸ODN组,有显著性差异(P<0.05),与假手术对照组相比有显著性差异(P<0.05)。 【结论】: 1、脂质体在一定程度上可以转染NF-κB decoy ODN进大鼠体内,但是其本身的靶向性将改变被转运物质的靶向性; 2、NF-κB decoy ODN需要借助载体转染才能提高其在靶细胞的浓度,但是其靶向性又明显受载体靶向性的干预; 3、NF-κB诱捕物(decoy)对重症急性胰腺炎时NF-κB有较强的亲和力和对NF-κB激活有显著的抑制作用; 4、重症急性胰腺炎时NF-κB的激活或抑制对炎症因子表达水平有显著的上调或下调的作用; 5、NF-κB decoy ODN降低重症急性胰腺炎炎症因子表达水平同时对早期肺、肝和胰腺的损伤有所改善。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R657.51

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