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《第一军医大学》 2007年
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一种耐药变形杆菌的分离、鉴定及其免疫学效应的实验研究

王鹏  
【摘要】:背景 疫苗的诞生为人类防治疾病带来了革命性的变化。实践证明,免疫预防是预防和控制传染病最经济、最简便、最有效的手段。继20世纪80年代成功地消灭天花后,随着免疫学、微生物学、分子生物学的迅猛发展,疫苗的研制取得了长足进步。回顾疫苗的发展历史,从其生产的技术角度,可分为传统疫苗和新型疫苗两类。传统疫苗(classic vaccine)是直接将无毒或减毒的病原体作为疫苗接种到人或动物体内,刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答,从而预防疾病的发生。新型疫苗是用遗传重组、基因工程、蛋白质工程等现代生物技术生产的疫苗,具有传统疫苗无可比拟的优点。但由于一些问题的存在,新型疫苗在短期内仍不可能代替目前广泛使用的传统疫苗。而对于细菌、病毒感染性疾病等,细菌疫苗仍是重要的研究方向。特别是随着抗生抗生素的广泛应用和不合理的使用,耐药及多重耐药细菌已经严重威胁着人类和动物的健康。从细菌染色体、质粒、转座子等遗传学和产生灭活酶、主动外输、渗透屏障、代谢、靶位改变和生物被膜形成等生物化学方面诱导细菌产生耐药的分子机制。克服细胞细菌耐药,严格控制抗生素的使用,开发一些天然抗菌肽和特异的细菌疫苗,以控制感染,是近年来对一些传染性和多药耐药感染性疾病治疗的重要研究方向。目前国际上在用的细菌疫苗约有15种,其中载入我国规程的有12科,分别是霍乱疫苗、伤寒疫苗、痢疾疫苗、百日咳疫苗、流脑多糖疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、肺炎多糖疫苗、钩端螺旋体疫苗、莱姆病疫苗、卡介苗、鼠疫疫苗、布氏菌病疫苗、炭疽疫苗,在临床应用中取得了一定的疗效。目前,其它菌苗也有相继报道。 本研究采用变形杆菌作为免疫原研究。变形杆菌(proteus species)是一类大小、形态不一的细菌,有时球形,有时丝状,呈明显的多形性,周身鞭毛,能运动且运动活泼,无芽孢荚膜,需氧及兼性厌氧,属革兰氏阴性菌。变形杆菌广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中,为条件致病菌,多为继发感染,如慢性中耳炎、创伤感染等,也可引起膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等。变形杆菌属包括普通突变形杆菌、奇异变形杆菌、莫根变形杆菌、雷极变形杆菌和无恒变形杆菌。其中以普通变形杆菌和奇异变形杆菌与临床关系较密切。特别是奇异变形杆菌可引起败血症,病死率较高。因此,控制变形杆菌引起的疾病对于临床感染性疾病治疗具有十分重要意义。作为菌苗控制疾病的主要机制在于其刺激机体免疫系统诱导体液免疫应答、细胞免疫应答,释放细胞因子和产生抗体,对细菌或病毒产生破坏或溶解。随着淋巴细胞激活的信号途径研究的不断深入,树突细胞在抗原递呈和免疫反应中的起着十分重要的作用。而乙肝在我国发病率较高,是肝癌和终木期肝病的重要病因,经研究乙肝病人树突细胞免疫信号分子表达和细胞免疫、体液免疫与健康人相比存在明显异常。为此,本研究选择乙肝病人外周血中树突细胞信号分子表达、细胞因子分泌,以及小鼠脾细胞增殖、脾细胞分泌细胞因子等体内外实验,探讨变形杆菌对树突细胞信号分子的表达和细胞免疫、体液免疫的影响,为变形杆菌应用于菌苗奠定了实验基础。 目的 本研究采用肠道菌选择培养基、鉴别培养基分离泌尿系统反复感染患者的尿液样本中的变形杆菌,经进一步鉴定和传代减毒后感染小鼠,分析脾细胞体外增殖能力和脾细胞分泌IL-2、IFN-γ水平及抗体变化;并通过流式细胞仪、酶联免疫斑点试验分析乙肝病人外周血树突细胞信号分子表达和IFN-γ水平变化,探讨变形杆菌对细胞免疫和体液免疫的影响,为变形杆菌菌苗研究奠定了实验基础。 方法 1.留取泌尿系统反复感染患者的尿液样本,将所取样品用分区划线法分别接种于肠道菌选择培养基(S,S琼脂)及鉴别培养基(伊红美蓝琼脂)平皿中,置37℃温箱培养18~24小时后,观察菌落特征,在培养后的平皿中找到符合变形杆菌菌落特点的菌落。将挑出的菌落做进一步的鉴定。 2.用Blendon镀银染色后观察、三糖铁琼脂培养基试验、动力靛基质尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验对挑出的菌落作初步鉴定。 3.从泌尿系统反复感染患者的尿液样本中分离的变形杆菌通过特殊的处理,将原有的毒性减低,并做毒性试验以证明其毒性的降低。再用三糖铁琼脂培养基试验、动力靛基质尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、迁徙生长试验、硫化氢产生试验、液化明胶试验、西蒙枸橼酸盐试验、吲哚试验、氨基酸脱羧酶试验、糖(醇、苷)类发酵试验(麦芽糖、木糖)、对氯霉素的敏感性试验对特殊处理后的菌种进行最后鉴定。鉴定无误后将经特殊处理的菌种接种、培养、采集、杀菌、离心、纯化,稀释成2×10~(11)/mL的原液,并对原液进行无菌试验和原液检定。 4.将变形杆菌原液用RPMI-1640培养液稀释成2×10~(10)/mL。采集慢性乙型肝炎患者和健康人肝素抗凝外周血,分离外周血单个核细胞,并体外定向诱导分化和培养树突状细胞。对照组为RPMI-1640培养基(含10%小牛血清)500μL+培养的树突细胞;实验组为RPMI-1640培养基(含10%小牛血清)500μL+培养的树突细胞+变形杆菌稀释液,用流式细胞仪检测CD80,CD86的表达水平。 5.将变形杆菌原液用蒸馏水稀释成2×10~9/mL,腹腔接种BALB/C小鼠。采用~3H-TdR摄入法检测小脾细胞经PHA、变形杆菌、ConA体外培养后脾增殖能力的变化;用ELISA法检测鼠血清抗体水平;并通过ELISA检测试剂盒检测脾细胞加入变形杆菌培养后IFN-γ和IL-2浓度。 6.取肝素抗凝外周血制备人外周血淋巴细胞,实验分为五组,分别为只加入培养基、HBcAg、HBcAg+变形杆菌培养液、HBsAg、HBsAg+变形杆菌培养液,用ELISPOT检测五组外周血淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ。 结果 (一)耐药变形杆菌的分离、鉴定和生产 1.分离的细菌符合变形杆菌的菌落特征 2.初步鉴定证明所分离细菌可能是普通变形杆菌三糖铁琼脂培养基呈黑色,并产生H_2S气体;动力靛基质尿素酶试验结果为动力阳性、靛基质阳性、尿素酶试验阳性;苯丙氨酸脱氨酶试验出现绿色,结果为阳性。 3.最后鉴定证明所分离细菌是普通变形杆菌毒性试验结果说明经传代培养后变形杆菌的毒性出现显著下降(传代培养前后LD_(50)分别为1.35×10~6和7.92×10~7)。三糖铁琼脂培养基试验+、动力靛基质尿素酶试验+、苯丙氨酸脱氨酶试验+、迁徙生长+、硫化氢产生+、液化明胶+、西蒙枸橼酸盐d、吲哚试验+、氨基酸脱羧酶一、麦芽糖+、木糖+、对氯霉素敏感性R,证明原始菌种为普通变形杆菌。将原始菌种制成2×10~(11)/mL的变形杆菌原液。 (二)变形杆菌能显著提高体外培养的慢性乙型肝炎患者树突状细胞CD80,CD86阳性细胞百分率 通过体外分离HBV感染病人和健康人外周血树突细胞,正常人的CD80,CD86的表达阳性百分率均大于慢性乙型肝炎病人(P=0.000,P=0.000);经变形杆菌培养48h后,慢性乙肝病人CD80,CD86的表达率显著增加(P=0.000,P=0.000),而健康人的CD80、CD86表达阳性百分率改变不显著(P=0.185,P=0.118)。 (三)变形杆菌对小鼠免疫有一定的影响 1.变形杆菌能够增加小鼠脾淋巴细胞的增殖能力 小鼠经变形杆菌液腹腔种后(1次/周,2周),采用~3H-TdR摄入法检测,经PHA或变形杆菌培养后,与对照组相比小鼠淋巴细胞均出现显著的增殖反应(PHA组t=-27.860,P=0.000;变形杆菌组t=-14.630,P=0.000)。采用变形杆菌和ConA共同与脾细胞培养后,三种不同剂量的变形杆菌刺激后脾细胞增殖反应与对照组相比均具有显著差异(0.5mL实验组、1mL实验组、2mL实验组均为P=0.000)。 2.变形杆菌对小鼠外周血抗体IgG2a的影响对变形杆菌接种小鼠后血清IgG抗体亚型IgG2a进行了检测,结果表明:三个实验组小鼠变形杆菌均能诱导小鼠产生IgG2a抗体;与对照组相比均具有显著差异(0.25mL实验组P=0.015,0.5mL实验组和1mL实验组P=0.000)。 3.变形杆菌能够增加小鼠脾细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-2不同剂量(0.1mL、0.3mL、0.9mL)变形杆菌接种小鼠后,取脾细胞与变形杆菌培养48 h后,不同剂量实验组较对照组(腹腔注射生理盐水)产生细胞因子IFN-γ显著增加(三组均为P=0.000),而以0.9mL实验组增加最为显著(与0.1mL组、0.3mL组比均为P=0.000);不同剂量实验组较对照组(腹腔注射生理盐水)产生细胞因子IL-2显著增加(三组均为P=0.000),而以0.9mL实验组增加最为显著(与0.1mL组、0.3mL组比均为P=0.000)。 (四)变形杆菌可促进慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞分泌IFN-γ分离乙肝病人外周血淋巴细胞,采用ELISPOT方法检测HBV患者外周血淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ。结果显示:HBcAg+变形杆菌实验组产生的斑点数显著高于HBcAg实验组(P=0.031,x~2=0.797),HBsAg+变形杆菌实验组产生的斑点数也显著高于HBsAg实验组(P=0.048,x~2=1.033)。结论 (一)通过肠道选择培养基和鉴别培养基分离反复尿路感染病人尿中变形杆菌,方法可靠,经进一步鉴定和传代后毒力明显下降。 (二)变形杆菌能够显著增加乙肝病人外周血中树突细胞CD80和CD86阳性细胞百分率,对正常人外周血中树突细胞CD80和CD86表达的阳性细胞百分率并不增加。 (三)变形杆菌腹腔感染小鼠后,能够增加脾细胞的体外增殖能力和脾细胞分泌IL-2和IFN-γ水平。 (四)变形杆菌可促进慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞分泌IFN-γ。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R378

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