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《第一军医大学》 2007年
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聚乙二醇化干扰素α-2a与干扰素α-2a在体内和体外的抗乙型肝炎病毒活性研究

梁蔚芳  
【摘要】: 乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科,具有严格的种属和组织特异性,它只传染人和类人猿等灵长类动物,或者是这些动物的原代培养肝细胞。病毒与靶细胞受体结合进入体内,在肝细胞特异性细胞因子作用启动病毒复制。在研究HBV过程中,需要建立HBV相关的体外培养模型及小型动物模型。目前的稳定转染细胞系如HepG2.2.1.5和含HBV全基因组的转基因鼠均可以产生病毒血症,但其HBV DNA是整合到宿主染色体组上,与HBV自然传染不同。腺病毒宿主广泛,能够传染多种细胞,介导的基因转移具有高效性,可将外源基因直接转移到靶细胞中,并使其在细胞内有效表达成活性蛋白,进入细胞核后以附加体形式存在,并可启动病毒复制。为了克服HBV的种属屏障,本文利用重组腺病毒载体介导复制型的HBV,将HBV基因组转入LO2肝细胞株和昆明小鼠,构建一种新的HBV细胞模型和动物模型。同时,利用该细胞模型及动物模型在体外和体内研究普通干扰素IFNα-2a与聚乙二醇化干扰素Peg-IFNα-2a的抗病毒活性,并探讨IFNα-2a与Peg-IFNα-2a在体外和体内对HBV的第一个复制中间体cccDNA的清除是否存在差异。 1.重组腺病毒的生物学特征的鉴定 利用所构建的具复制能力的HBV重组腺病毒传染体外培养肝细胞,观察HBV的表达情况,从而初步了解该重组HBV腺病毒的生物学特性。 以复制型HBV重组腺病毒,传染293细胞,大量制备重组腺病毒。PCR证实该重组腺病毒基因组中整合有HBV DNA,经连续传代的重组腺病毒中均可扩增出目的条带,具有遗传稳定性;以不同剂量的重组腺病毒传染LO2细胞,结果表明,传染剂量越大,HBsAg和HBeAg的表达越强;但当传染复数超过50时,细胞较易出现老化脱落等现象。可能是因为除了细胞正常生长外,传染的过程中需要更多的能量,从而也加快了宿主细胞的生长代谢。 以25 pfu/细胞的重组腺病毒传染三种肝源性细胞株:人肝癌细胞株HepG2细胞、人正常肝细胞株LO2细胞和禽肝细胞株LMH。RT-PCR在三种传染肝细胞中均能检测到HBV特异的mRNA;ELISA在三种传染肝细胞的培养上清中均能检出HBsAg和HBeAg,表明重组腺病毒均可以介导HBV在该三种不同来源的肝细胞中建立HBV的传染状态。HBV可在异种肝细胞内复制,HBV蛋白能够表达,从而认为,HBV DNA的复制与表达无严格的种属特异性限制,而是肝细胞内环境依赖性的。HBsAg和HBeAg的表达量随时间而增加,第五、六天达到高峰,其后有所下降。禽肝细胞HBsAg和HBeAg的表达量均低于另两种人源化肝细胞,认为可能与HBV表达的组织特异性有关。人肝癌细胞株HepG2细胞抗原的表达量高于人正常肝细胞株LO2细胞,认为因肝癌细胞的分裂生长及合成代谢均高于正常细胞,因而使得HBsAg和HBeAg的表达量也随之增高。 重组腺病毒传染细胞后,连续七天在细胞内均可检测到腺病毒载体,证明了重组腺病毒对细胞的易感性和高效的基因转移能力。重组腺病毒传染细胞后第三天可以在培养上清中检测到腺病毒基因,随着培养时间的延长,培养上清中腺病毒含量增加。可能是随着培养时间的延长,细胞增殖到一定程度后开始老化、死亡、脱落,从而使部分重组腺病毒释放进培养上清中。 2.重组腺病毒传染LO2细胞后HBV复制的动态分析 将重组腺病毒介导的具自行复制能力的HBV传染人正常肝细胞株LO2,获得能表达HBV标志物的细胞模型,应用酶联免疫技术动态观察LO2细胞内HBsAg和HBeAg的表达;HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA载量;合成特异性引物并结合荧光定量PCR技术,检测细胞内cccDNA的水平,旨在探讨重组腺病毒传染后HBV在细胞内的复制规律。 以25 pfu/细胞的重组腺病毒传染LO2细胞,病毒吸附3小时后,去掉培养液,并以PBS冲洗3遍后,加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液1ml/孔,过夜培养。24小时后开始收集细胞上清及细胞,连续八天,-20℃保存。 以血清DNA抽提试剂盒提取培养上清中DNA,HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBVDNA含量。 ELISA法检测培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌。 以不含蛋白酶的裂解液裂解细胞,利用cccDNA和rcDNA与蛋白质结合能力的差异提取cccDNA,并以绿豆核酸酶消化残留的rcDNA;利用cccDNA和rcDNA结构上的差异,设计跨越负链缺口的引物,并通过荧光定量PCR检测cccDNA,探讨重组腺病毒传染LO2细胞后细胞内cccDNA的变化。 以病毒含量分别为10~7、10_6拷贝/ml的乙型肝炎患者血清进行引物的特异性检测,结果均为阴性,证明引物对HBV cccDNA具有特异性。 质粒标准品倍比稀释为10~2,10~3,10~4,10~5,10~6,10~7拷贝/ml进行引物的敏感性检测,质粒在10~3-10~7范围内均能检测到信号,因此,该方法的敏感性可以达到10~3拷贝/ml。 以该特异性引物进行荧光定量PCR检测重组腺病毒传染后L02细胞后细胞内cccDNA的量,cccDNA在传染后一天即可在细胞内检测到,第四天达到高峰,随后呈下降趋势,但仍维持相对稳定状态。认为cccDNA的稳定维持在一定水平,既能满足病毒复制的需要,又不会对细胞产生毒性,有利于维持病毒对细胞的长期传染状态。 HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA,培养上清中HBV DNA含量在病毒传染细胞后第五天达到最高,随后维持稳定状态。 ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌,HBsAg和HBeAg的表达量随培养时间的延长而增加,第六天达到高峰,随后呈下降趋势。一是由于细胞生长已到达平台期,细胞内已建立一种稳定的病毒传染状态;二是随着时间的延长,培养的细胞几乎停止分裂生长,细胞合成代谢功能降低,出现老化现象,因此完全依赖于细胞功能才能进行复制和表达的病毒,其复制水平也会随之下降。 对HBV cccDNA、HBV DNA、HBsAg和HBeAg进行Spearman相关性分析,培养上清中HBV DNA的量与HBsAg和HBeAg的分泌量之间存在正相关关系,分别为:r_s=0.881,P=0.004(双侧);r_s=0.857,JP=0.007(双侧),从而认为HBV蛋白表达规律与培养上清中HBV DNA相关,而细胞内HBV cccDNA与培养上清中HBV DNA的量及HBsAg和HBeAg的分泌量之间无明显相关性(P>0.05)。 3.IFNα-2a与Peg-IFNα-2a在体外对HBV复制的影响 以重组腺病毒传染的LO2细胞为细胞模型,通过观察IFNα-2a与Peg-IFNα-2a处理前后培养上清HBV DNA、细胞内HBV cccDNA、HBsAg与HBeAg的变化,比较IFNα-2a与Peg-IFNα-2a的体外抗病毒作用,并观察该两种干扰素对乙型肝炎病毒复制的第一个环节有无抑制作用。 以25 pfu/细胞的重组腺病毒传染LO2细胞,病毒吸附3小时后,去掉培养液,并以PBS冲洗3遍,加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液1ml/孔,过夜培养。将细胞分为三组,一组以IFNα-2a处理,药物用量分别为100 IU/ml、500 IU/ml、1000 IU/ml,每两天一次;一组以Peg-IFNα-2a处理,药物用量分别为3.6×10~(-3)μg/ml、1.8×10~(-2)μg/ml、3.6×10~(-2)μg/ml;对照组不加;每组设三个复孔,细胞维持培养一周。 以MTT法进行细胞毒性检测,在本实验浓度下,IFNα-2a与Peg-IFNα-2a对腺病毒传染的LO2细胞均无细胞毒性作用(P>0.05)。 细胞以药物处理后连续培养7天,收集培养上清;细胞以PBS洗涤3次后,胰蛋白酶消化,收集细胞进行细胞计数。以血清DNA抽提试剂盒提取培养上清DNA;以不含蛋白酶的裂解液裂解细胞,提取细胞内cccDNA。 ELISA法检测培养上清HBsAg和HBeAg的分泌;HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA;以HBV cccDNA特异性引物进行荧光定量PCR检测细胞内HBV cccDNA。 结果显示,Peg-IFNα-2a药物组中,三个药物浓度组处理的细胞中HBsAg及HBeAg与对照组比较,均无显著性差异(P>0.05)。IFNα-2a药物组中,剂量为100 IU/ml组的细胞分泌的HBsAg及HBeAg与对照组比较,无显著性差异(P>0.05);剂量为500 IU/ml组及1000 IU/ml组的细胞分泌的HBsAg及HBeAg与对照组相比显著减少(P<0.05,P<0.001),认为IFNα-2a在剂量为500 IU/ml以上时对重组腺病毒传染的LO2细胞的HBV抗原分泌有抑制作用。 HBV荧光定量PCR检测培养上清中HBV DNA及应用HBV cccDNA特异性引物进行荧光定量PCR检测细胞内cccDNA含量。Peg-IFNα-2a药物组中,三个药物浓度组处理的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组比较,均无显著性差异(P>0.05)。IFNα-2a药物组中,剂量为100 IU/ml组的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组比较,无显著性差异(P>0.05);剂量为500 IU/ml组及1000 IU/ml组的细胞培养上清中HBV DNA含量与对照组相比显著减少(P<0.05),认为IFNα-2a在剂量为500 IU/ml以上时对重组腺病毒传染的LO2细胞内HBV DNA的合成有抑制作用。比较各组细胞内HBV cccDNA,各药物组细胞与对照组细胞的cccDNA含量均无显著性差异(P>0.05),认为短期的药物处理不能抑制细胞内cccDNA的合成。 4.IFNα-2a与Peg-IFNα-2a在体内对HBV复制的影响 利用重组腺病毒传染小鼠,使HBV基因在小鼠体内表达,构建HBV传染的小鼠模型,利用该模型研究IFNa-2a和Peg-IFNot-2a的体内抗病毒作用,并观察IFNα-2a与Peg-IFNα-2a对小鼠体内HBV cccDNA的清除是否存在差异。 重组腺病毒以尾静脉注射的方法接种4周龄的昆明小鼠,接种剂量为2×10~9pfu,建立HBV传染的动物模型。分别以IFNα-2a与Peg-IFNα-2a对小鼠进行皮下注射,参照人体临床用药,IFNα-2a用药剂量为1.7×10~3IU/只,三次/周;Peg-IFNα-2a用药剂量为0.06μg/只,一次/周;以生理盐水为对照组,一次/周。分别于第4周和第8周观察腺病毒介导的HBV在小鼠体内的复制情况及药物对HBV在体内复制的影响。 提取两个药物组和对照组传染小鼠血清DNA及肝脏DNA,以HBV特异性引物进行PCR检测,传染小鼠血清及肝脏中结果均为阳性。 以腺病毒特异引物进行PCR反应,检测传染小鼠血清及肝脏中的腺病毒基因组。第4周时三组传染小鼠肝脏中均可检出腺病毒DNA,第8周时再次检测传染小鼠肝脏中腺病毒DNA,结果均为阴性;而三组传染小鼠血清中一直不能检测出腺病毒DNA。结果表明,小鼠血清中不含重组腺病毒,血清中的HBV DNA是由于病毒在体内复制而产生的子代病毒。 分别提取第4周和第8周时传染小鼠的肝脏RNA,以0.5μl DnaseⅠ处理提取物,除去污染的痕量DNA,RT-PCR检测HBV RNA。第4周和第8周时三组传染小鼠肝脏中均能检测出HBV特异的mRNA,证明传染小鼠肝脏中存在HBV的复制形式。以上结果表明,该重组腺病毒可以在小鼠体内建立HBV的传染状态。 采用ELISA法检测了小鼠血清中IFN-γ含量,各实验组间IFN-γ含量比较有显著性差异(P<0.001),但不同时间(第4周和第8周)各组IFN-γ含量比较无显著性差异(P>0.05)。各实验组进行两两比较,结果表明,Peg-IFNα-2a组和IFNα-2a组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05);比较两个药物组之间所诱生的IFN-γ的含量,Peg-IFNα-2a组高于IFNα-2a组(P<0.05)。认为Peg-IFNα-2a与IFNα-2a在体内均具有免疫调节能力,但Peg-IFNα-2a的免疫调节作用强于IFNα-2a。 荧光定量PCR检测小鼠血清HBV DNA,比较各实验组小鼠血清中的病毒含量变化,结果显示,两个药物组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05),表明两个药物对小鼠血清中病毒均有抑制作用。两个药物组之间比较无显著性差异(P>0.05);各实验组中血清病毒载量在第4周与第8周的差异无显著性(P>0.05),从而认为Peg-IFNα-2a与IFNα-2a在本实验时间范围内对小鼠血清中病毒的作用无差异。 传染小鼠肝脏DNA以绿豆核酸酶处理,以HBV cccDNA特异性引物进行荧光定量PCR检测传染小鼠肝脏中HBV cccDNA含量。结果显示,第4周与第8周时三组传染小鼠肝脏中HBV cccDNA含量均无显著性差异(P>0.05)。从而认为IFNα-2a与Peg-IFNα-2a虽然能抑制血清中的病毒复制,但对肝脏内HBVcccDNA的影响不显著。 结论:建立复制型HBV重组腺病毒的体外传染和体内传染模型。重组腺病毒在体外培养细胞中可以表达HBV、HBsAg和HBeAg,并可检测出HBV复制中间体。重组腺病毒传染小鼠,可以在小鼠体内检测到HBV复制中间体。利用该模型分别在体外和体内进行抗HBV活性的比较,IFNa-2a的体外抗病毒作用比Peg-IFNα-2a强;在体内,Peg-IFNα-2a具有较强的免疫调节能力;两个药物均能抑制血清中HBV的复制,但却对肝脏内HBV cccDNA的合成影响不大。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R373

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7 靳继德;刘铖;哈小琴;李元敏;吴祖泽;;携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒对大鼠局灶性脑缺血治疗的实验研究[A];全面建设小康社会:中国科技工作者的历史责任——中国科协2003年学术年会论文集(上)[C];2003年
8 祝成亮;鲁敏翔;胡汉宁;刘芳;周新;;热休克蛋白72重组腺病毒包装及其对细胞凋亡的影响[A];第四届全国血脂分析与临床学术研讨会暨第九届全国脂蛋白学术会议论文汇编[C];2008年
9 郭浩;彭毅志;辛海明;;小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建与鉴定[A];第八届西南五省一市烧伤整形学术会议暨贵州省医学会烧伤整形分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年
10 徐琳;陈杰;麻晓峰;高下;;构建人pAdeasy-NT3-DsRed2融合基因重组腺病毒[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编(下)[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 吴一福;重组腺病毒核糖核酸酶载体问世[N];中国医药报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李凯;汉滩病毒多组分新型重组腺病毒的制备及免疫学特性研究[D];第四军医大学;2013年
2 陈漉;特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究[D];吉林大学;2009年
3 李文辉;基于重组腺病毒的狂犬病毒基因工程疫苗研究[D];中国协和医科大学;2001年
4 陶陶;重组腺病毒HIF-1α基因治疗脑缺血的实验研究[D];重庆医科大学;2005年
5 马臻;HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒的构建及对肝细胞生物学行为的影响[D];重庆医科大学;2006年
6 周继章;鸡源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因重组腺病毒活载体疫苗研究[D];中国农业科学院;2006年
7 王澜;重组腺病毒介导人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因对恶性肿瘤生物治疗的临床前研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
8 梁蔚芳;聚乙二醇化干扰素α-2a与干扰素α-2a在体内和体外的抗乙型肝炎病毒活性研究[D];第一军医大学;2007年
9 张林;SCL转基因联合SCF促Cajal间质细胞恢复的在体实验研究[D];第三军医大学;2007年
10 张云嵩;Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合光动力疗法对非小细胞肺癌治疗作用的实验研究[D];第三军医大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘凯;乙脑E基因和猪白细胞介素6基因重组腺病毒的构建与初步免疫研究[D];四川农业大学;2013年
2 唐丹;嗜肝细胞重组腺病毒基因治疗载体的构建[D];重庆医科大学;2010年
3 焦月盈;表达人呼吸道合胞病毒结构蛋白的重组腺病毒及杆状病毒的构建与鉴定[D];北京交通大学;2011年
4 邱亚;重组腺病毒rhAdEasy-nm23-H1的构建与鉴定及体外表达的实验研究[D];昆明医学院;2006年
5 苏永良;力生长因子、E肽重组腺病毒的构建及其在神经细胞中的表达[D];西南大学;2013年
6 温中梅;特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究[D];吉林大学;2010年
7 齐延新;重组腺病毒纯化、质量控制及安全性评价初步研究[D];吉林大学;2013年
8 葛玮;Dmrt7基因重组腺病毒及腺相关病毒载体的构建及鉴定[D];西北农林科技大学;2010年
9 朱晓梅;嗜肝性重组腺病毒基因治疗载体的构建及功能鉴定[D];重庆医科大学;2011年
10 李亚琼;hIFN-γ重组腺病毒的构建[D];四川大学;2006年
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