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《第一军医大学》 2007年
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药物敏感试验指导小鼠多次传代胃癌化疗的实验研究

孙涛  
【摘要】: 研究背景 胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一,目前的治疗效果颇不令人满意,单靠手术很难获得良好的效果,且术后复发率较高,因此,手术后的辅助治疗就特别重要。化疗在胃癌的辅助治疗中占有重要的地位。但化学治疗在胃癌手术后的辅助治疗中疗效并不理想,化疗药物敏感性较差,其原因涉及肿瘤细胞增殖、凋亡、耐药形成、治疗方案缺乏个体化等多方面,因肿瘤有异质性和多药耐药现象,不同个体的相同组织类型肿瘤及同一个体肿瘤的发展不同阶段,对同一药物的敏感性不同,临床化疗采用不变的化疗药或采用经验化疗有一定的缺陷。随着分子生物技术的飞速发展,一些基因诊断试剂盒和芯片将会在临床肿瘤药物治疗中得到广泛的应用,医生可根据肿瘤患者的基因资料给药,达到个体化化疗的目的。因此,如何选择敏感抗癌药,制定胃癌的个体化治疗方案,是提高胃癌化疗的关键。 目的 我们通过应用药敏试验筛选化疗药物,对多次传代的荷瘤鼠进行化疗,观察临床疗效,检测小鼠胃癌组织中凋亡、耐药、增殖及转移相关基因的表达,探讨临床化疗药物的选择、并分析是否与其临床疗效及基因表达一致,以便实施科学的、药物适配的个体化方案。 方法和结果 多药耐药(Multidrug resistance MDR)是造成化疗失败的主要原因,也是肿瘤化疗急需解决的难题。肿瘤细胞的耐药性是胃癌对化疗不敏感的主要原因,晚期胃癌患者接受传统化疗后,较短的缓解期,可能与较快出现的耐药有关。其中多药耐药基因1(MDRl)编码的产物P-糖蛋白(P-gp)介导的多药耐药研究最多,研究表明P-gp/MDRl过度表达是肿瘤产生多药耐药的分子基础。MDRl能逆浓度梯度将化疗药物进入细胞内的有毒化学成分排除体外,在肿瘤组织中表达增高,这种耐药机制适用于天然或半天然疏水性亲脂细胞毒性药物,包括抗肿瘤抗生素如蒽环类抗生素、放线菌素D、丝裂霉素以及抗肿瘤植物碱类、秋水仙碱等。我们实验发现,选用小鼠胃癌细胞株不敏感的化疗药阿霉素进行全身化疗后,其疗效、抑瘤率低,其MDRl的基因表达高,对第二代荷瘤小鼠仍采用阿霉素进行全身化疗组,结果相似,而用药敏试验筛选出小鼠胃癌细胞株敏感的化疗药5-氟尿嘧啶,对第一代荷瘤小鼠进行全身化疗,其疗效好,抑瘤率高,但其MDRl的基因表达也高,分析MDRl基因表达高的原因可能是肿瘤细胞本身产生抗药性,具有原发性耐药,而第一代荷瘤小鼠进行化疗后,5-氟尿嘧啶化疗后的肿瘤细胞筛选出最敏感的化疗药是顺铂,阿霉素化疗后的肿瘤细胞筛选出最不敏感的化疗药是丝裂霉素,用顺铂对第二代荷瘤小鼠进行化疗,发现顺铂组疗效好,抑瘤率高,但其MDRl的基因表达较对照组、5-氟尿嘧啶组及阿霉素组无显著性差异,用丝裂霉素对第二代荷瘤小鼠进行化疗,发现丝裂霉素组疗效差,抑瘤率低,其MDRl的基因表达较对照组、顺铂组、5-氟尿嘧啶组及阿霉素组明显升高,说明丝裂霉素化疗后可能上调了MDRl的表达,荷瘤小鼠用不敏感药化疗后MDRl的表达增高,表明化疗后有可能获得性耐药,MDRl基因表达阳性者选用抗生素类化疗药如阿霉素、丝裂霉素疗效不佳,而选用顺铂疗效好,和药敏试验相符,故MDRl基因表达阳性者应避免天然或半天然抗癌药,而可选择与P-gp关系不大的烷化剂和抗代谢类药物。 细胞凋亡在胃癌的发生中发挥着特定的作用,胃癌的发生发展和细胞凋亡密切相关,是细胞凋亡和增殖失衡所至。细胞凋亡是一种主动的受基因调控的细胞自杀过程,许多人体基因如p53、bcl-2等参与凋亡的调控。癌细胞凋亡率的降低可能与P53基因突变及其蛋白异常表达有关,肿瘤中的P53蛋白可增至正常的5-10倍。bcl-2过度表达特异性地抑制细胞在应答某些刺激时发生的细胞凋亡,促进癌发生,增加肿瘤的播散侵袭能力,也称凋亡抑制基因,研究发现bcl-2在胃癌中也有异常表达。bcl-2的表达与临床上多种肿瘤的预后有关,bcl-2表达下降的胃癌,凋亡指数明显增加。诱导细胞凋亡可能是化疗药物抑制肿瘤的主要机制之一,化疗药物调节癌基因表达,调控胃癌细胞凋亡的基因改变,可诱导凋亡发生,调节增殖与凋亡的比率,可达到使肿瘤消退的目的。化疗药物可通过P53、bcl-2途径介导细胞凋亡。通过本实验可以看出,用药敏试验先筛选出小鼠胃癌细胞株敏感的化疗药5-氟尿嘧啶,对第一代荷瘤小鼠进行全身化疗,其疗效好,抑瘤率高,肿瘤细胞凋亡率高,P53蛋、bcl-2蛋白表达低,选用小鼠胃癌细胞株不敏感的化疗药阿霉素进行全身化疗后,其疗效、抑瘤率低,肿瘤细胞凋亡率低,P53蛋、bcl-2蛋白表达高,而第一代荷瘤小鼠进行化疗后,通过药敏试验发现肿瘤细胞对化疗药物的敏感性发生了变化,5-氟尿嘧啶化疗后的肿瘤细胞筛选出最敏感的化疗药是顺铂,阿霉素化疗后的肿瘤细胞筛选出最不敏感的化疗药是丝裂霉素,用顺铂对第二代荷瘤小鼠进行化疗,发现顺铂组疗效好,抑瘤率高,肿瘤细胞凋亡率高,P53蛋、bcl-2蛋白表达低,用丝裂霉素对第二代荷瘤小鼠进行化疗,发现丝裂霉素组疗效差,抑瘤率低,肿瘤细胞凋亡率低,P53蛋、bcl-2蛋白表达高。故认为诱导肿瘤细胞凋亡是成功治疗肿瘤的基础和关键,化疗药物除通过各自的靶点直接作用外,也可以通过诱导细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞。我们的实验通过用药敏试验筛选的化疗药物对荷瘤小鼠进行化疗,对凋亡及P53、bcl-2基因表达的研究,为肿瘤化疗药物的选择和预后判断提供重要的思路和方法。 肿瘤的生长、侵袭和转移是受多因素影响的复杂过程,其前提和基础是肿瘤细胞的不断增殖。寻找肿瘤浸润、转移的特异性指标有助于对胃癌患者预后进行判断,并采取更有效的治疗措施,根据具体情况决定个体化治疗方案,以提高胃癌患者的术后生存率。erbB-2是一种原癌基因,具有酪氨酸激酶活性,是表皮生长因子受体家族中的成员,正常细胞不表达。在多种恶性肿瘤中过度表达,阳性率占各种肿瘤的10%~60%不等,且与预后及疗效关系密切,是肿瘤恶化的一种标志,erbB-2蛋白的功能包括参与细胞增殖、细胞分化等,erbB-2基因活化,结构发生改变,导致过表达,刺激细胞增生、浸润和转移,其表达过度常常提示肿瘤的增殖能力强,恶性程度高,预后差,与转移及化学耐药有关。p53是一个抑癌基因,它的突变与肿瘤增殖、转移有关,突变型P53蛋白表达的增加往往会使肿瘤细胞增殖能力增强,甚至在一些恶性肿瘤中,细胞失去野生型p53的功能是发生转移的必要条件。当肿瘤发生转移时,往往会出现突变的P53蛋白的过表达,突变的P53蛋白的过表达所引起的转移往往与肿瘤血管生成有密切关系。我们用药敏试验先筛选出小鼠胃癌细胞株敏感的化疗药5-氟尿嘧啶,对第一代荷瘤小鼠进行化疗,其疗效好,抑瘤率高,erbB-2、P53表达低,选用小鼠胃癌细胞株不敏感的化疗药阿霉素进行化疗后,其erbB-2、P53表达和对照组比较无显著性差异,而第一代荷瘤小鼠进行化疗后,再次行药敏试验发现,5-氟尿嘧啶化疗后的肿瘤细胞筛选出最敏感的化疗药是顺铂,阿霉素化疗后的肿瘤细胞筛选出最不敏感的化疗药是丝裂霉素,用顺铂对第二代荷瘤小鼠进行化疗,发现顺铂组疗效好,抑瘤率高,erbB-2、P53表达低,用丝裂霉素对第二代荷瘤小鼠进行化疗,发现丝裂霉素组疗效差,抑瘤率低,erbB-2、P53表达高。对第二代荷瘤小鼠仍采用5-氟尿嘧啶和阿霉素进行化疗,发现5-氟尿嘧啶组、阿霉素组疗效不好,抑瘤率低,erbB-2、P53表达高。从本研究看出,通过药物敏感实验筛选化疗药物,指导小鼠胃癌的化疗,选用小鼠胃癌细胞敏感的化疗药进行化疗后,其erbB-2、P53表达降低,临床疗效好,和药物敏感实验相符。 结论 上述结果提示,用小鼠胃癌细胞筛选的化疗药物对荷瘤小鼠进行化疗,其疗效和药敏实验一致,能诱导小鼠胃癌细胞凋亡,抑制erbB-2、P53、bcl-2基因表达,小鼠胃癌组织具有内源性MDRl,有较高的原发性耐药,且在化疗过程中可能诱导耐药,这可能是胃癌化疗效果不佳的原因之一。因此,化疗前的药敏实验除可指导用药,避免盲目选用非敏感化疗药对机体造成不必要的毒性反应,还可以发现耐药的病例,在检测肿瘤对化疗药物敏感性同时,建议检测凋亡、耐药、增殖及转移相关基因的表达,根据基因的检测结果,选择适配的化疗方案可以使临床疗效更佳,对提高肿瘤的治疗率,减轻药物的毒副作用,减少盲目性和发生耐药的可能具有重要的意义。总之,本文建立了药敏试验的动物模型,阐明了肿瘤个体化疗的重要性,当然动物试验和人体有差异,体内和体外试验也有差异,还需要进一步的、更多的实验来摸索和探讨。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R735.2

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