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《第一军医大学》 2007年
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TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞CF-6表达的作用机制及其药物干预研究

叶泽兵  
【摘要】: 目的:高血压是临床常见病和多发病,常常是心肌梗死、心力衰竭、血管疾病、脑卒中和肾病等发病的主要危险因素,严重地威胁和危害着人类的身心健康。在世界范围内,心血管疾病位于所有疾病死亡率之首位。在过去的几十年中,中国高血压的患病率正在快速增长,2002年中国成年人中估计的高血压患病率已从1991年的11.88%增加到18.8%,且高血压的知晓率、治疗率和控制率均有待提高。高血压是一种常见的多因素所致的疾病,涉及到遗传,环境,人口统计学,血管及神经内分泌等多方面的因素,其发病机制迄今尚未有完全阐明。但大量实验和临床资料都表明血管内皮功能紊乱、内皮细胞合成和分泌的调节血管紧张性的多种活性分子间的平衡失调,具有重要的发病学意义。已知PGI_2是血管内皮细胞合成和释放的内皮因子。在凝血酶、血栓素等多种因素刺激下磷脂酶A_2(phospholipase A_2,PL A_2)激活,水解质膜的磷脂分子释放花生四烯酸(arachidonic acid,AA),经环氧化酶和PGI_2合成酶代谢生成PGI_2。PGI_2通过与细胞膜上G蛋白偶联受体相结合,激活腺苷酸环化酶,增加cAMP的含量,促进颗粒膜上的蛋白磷酸化,增加颗粒膜对[Ca~(2+)]的吸收,降低血小板内游离的[Ca~(2+)]水平,从而发挥其松弛平滑肌细胞和抑制血小板聚集作用,此外也可使已聚集的血小板解聚。1990年有学者发现自发性高血压大鼠(SHR)其血压随年龄的增加而增高,研究者们推测在高血压大鼠血浆中存在内源的PGI_2合成抑制物参与了高血压的发生。线粒体ATP合酶的一个亚单位线粒体偶联因子6(CF6)是一种内源性的前列环素合成抑制剂,具有强烈的收缩血管升高血压效应。细胞合成的CF6最初在胞浆内是无活性的前体大分子多肽,蛋白水解酶催化去掉信号肽(32个氨基酸)转变为活性形式,进入线粒体内和其他蛋白形成复合体进行能量转导。人的CF6前体由108个氨基酸组成,其中CF6由76个氨基酸组成,分子量分别为12.6 kDa和8.9kDa。CF6在体内的各种组织中均有分布,心肌中CF6含量最高,其它组织依次是肝、肾、脑、肺和肠,体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及其细胞系ECV 304细胞膜上都富含CF6。血管内皮细胞具有合成分泌CF6的功能,可能是血液循环中CF6的重要来源。研究发现CF6在高血压病人血浆中的浓度明显高于正常人,CF6可能是高血压的重要发病因子之一。然而到目前为止,CF6的表达、分泌调节机制还不太清楚。我们应用肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察HUVEC经TNF-α刺激后胞内CF6的表达改变和其分泌到胞外的情况,同时进一步分析其具体的调节机制,从而在分子水平上探讨TNF-Q信号通路调节CF6表达的作用机制,进而研究TNF-α/CF6信号通路在高血压发生发展中的作用机制;应用噻唑烷二酮(TZDs)类药物曲格列酮干预TNF-α/CF6信号途径,以探讨TZDs类药物在防治高血压中的作用机制。 方法: 1.参照Jaffe和Vale′rie Marin等方法并加以改进,从人脐静脉分离出内皮细胞进行原代培养,对原代及传代的HUVEC细胞进行血管内皮细胞特异抗原检测,以鉴定其是否为血管内皮细胞。同时优化条件以备以下实验所用。 2.应用TNF-α(100~250ng/ml)刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。采用RT-PCR方法检测CF6 mRNA不同时间的表达变化,流式细胞术检测CF6在细胞膜上的表达,RIA检测培养基中和细胞匀浆中CF6的含量。采用免疫荧光染色观察NF-kappaB的细胞定位改变,蛋白质印迹分析检测细胞核中NF-kappaB p65不同时间的表达变化,同时检测胞浆中IκBα的含量变化。 3.应用TNF-α(100~250ng/ml)刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的同时加入不同浓度曲格列酮(0.08、0.8、8 uM)处理不同时间。检测细胞膜上和培养上清中CF6随时间延长的表达改变,NF-κB p65活化情况以及细胞中IκBα的含量变化。 结果: 1.用1%Ⅱ型胶原酶消化20 cm长脐带所收获的内皮细胞,可以接种底面积为50cm~2培养瓶一瓶,密度约为105~10~6/mL。接种4h后细胞开始贴壁,12h后大部分贴壁,24h后即可第一次换液除去未贴壁的红细胞。早期的内皮细胞多呈小多角形、球形、短梭形,细胞单层生长,互不重叠。当原代细胞接种密度达到10~5~10~6/mL时,在接种48~72h生长最旺盛,4~5d即可融合。融合后的HUVEC为扁平多角形,呈典型的鹅卵石或铺路石样排列。第二代的内皮细胞如接种密度在10~5~10~6/mL,传代的内皮细胞48小时内即融合,接种密度小于10~5/mL则生长极慢。对原代及传代HUVEC内的Ⅷ因子相关抗原进行免疫细胞化学染色,99%以上的细胞胞浆内有棕黄色的颗粒,胞浆着棕黄色,胞核蓝色,证实为血管内皮细胞。 2.TNF-α(100~250U/ml)呈剂量依赖性上调HUVEC细胞CF6的表达和分泌。RT-PCR结果分析显示CF6 mRNA在TNF-α100U/ml处理细胞1.5h表达增加,之后又恢复到正常水平,在TNF-α250U/ml处理细胞1h表达增加,之后又恢复到正常水平。RIA结果显示细胞培养上清中,HUVEC细胞在未加入TNF-α处理24h后CF6的含量为20.2±0.97ng/dish(注:每dish有5×10~5个细胞),48h后培养上清中CF6含量为49.8±13.3;HUVEC细胞培养液中加入TNF-α100U/ml处理24h后培养上清中CF6含量为59.8±6.7ng/dish,处理48h后培养上清中CF6含量为117±22.3;HUVEC细胞在加入TNF-α250U/ml处理24h后培养上清中CF6含量为76.9±7.6 ng/dish,处理48h后培养上清中CF6含量为220.6±21.6。从结果分析,细胞培养上清中CF6含量随TNF-α处理浓度的升高而相应增加。经重复测量方差分析,不同处理组间差异有显著性(F=150.401,P=0.000)。流式细胞术分析显示CF6在HUVEC细胞膜上的表达随TNF-α处理浓度的增高也相应增加。 3.CF6随TNF-α处理时间的延长在HUVEC细胞株中的表达和分泌也相应的增加。RIA结果显示胞株经TNF-α250U/ml刺激后6h、12h、24h、48h培养上清中CF6的含量分别是31.1±5.2ng/dish、49.0±5.8ng/dish、76.9±7.5ng/dish、220.6±24.1ng/dish,阴性对照组(即HUVEC细胞培养上清中未加入TNF-α刺激)中6h、12h、24h、48h CF6的含量分别是12.4±1.7ng/dish、19.8±3.4ng/dish、34.6±2.4ng/dish、60.8±9.5ng/dish,从结果分析细胞培养上清中CF6随TNF-α处理时间的延长其总量也相应的增加,经重复测量方差分析,不同时间之间差异有显著性(F=10219.946,P=0.007)。而细胞匀浆中CF6的表达在TNF-α处理24h内一直处于稳定状态,而24h后反而有下降趋势,但不明显。 4.TNF-α(250U/ml)可激活细胞内NF-κB。免疫荧光染色可见HUVEC细胞株经TNF-α(250U/ml)处理后,NF-κB p65核易位,Western blot结果显示核蛋白NF-κB p65表达增加,同时细胞中IκBα的含量明显降低。 5.TZDs类药物曲格列酮可抑制TNF-α刺激的CF6表达上调。RT-PCR结果分析显示在TNF-α250U/ml和曲格列酮同时处理细胞的情况下,CF6 mRNA一直处于稳定表达状态。RIA结果显示经TNF-α250U/ml处理的HUVEC细胞培养上清中,在未加入曲格列酮处理的情况下6h、12h、24h、48h CF6的含量分别是34.6±3.9ng/dish、52.6±5.2ng/dish、84.4±8.9ng/dish、250.6±27.6ng/dish,而加入了曲格列酮处理的情况后6h、12h、24h、48h的含量分别是18.8±1.6ng/dish,24±1.9ng/dish、44.8±4.9ng/dish、75.6±7.6ng/dish,从结果分析,曲格列酮可抑制TNF-α刺激的CF6表达上调。经重复测量方差分析,显示不同处理组间差异有显著性(F=702.947,P=0.000)。流式细胞术分析显示曲格列酮抑制了TNF-α刺激的CF6在HUVEC细胞膜上的表达。免疫荧光染色可见HUVEC细胞株曲格列酮可抑制经TNF-α(250U/ml)处理后,NF-κBp65核易位改变,Western blot结果显示TNF-α刺激的核蛋白NF-κB p65表达增加也被抑制,同时细胞中IκBα的含量也没有改变。 结论: 1.本文以上述方法成功分离并培养出HUVEC细胞。 2.TNF-α呈剂量依赖性和时间依耐性上调HUVEC细胞CF6的表达和分泌。 3.TNF-α促进HUVEC细胞CF6的表达,其增加的蛋白主要分布到膜上和分泌到胞外,胞内CF6的含量始终处于一个稳定的水平。 4.TNF-α刺激血管内皮细胞CF6的表达和分泌,CF6的高表达又是引起高血压的一个重要因素,因此TNF-α可能参与高血压发生发展机制之一。 5.NF-κB在TNF-α介导的上述效应中起关键桥梁作用,干预NF-κB信号可能成为防治高血压的靶标。 6.TZDs类药物曲格列酮可抑制TNF-α对NF-κB激活,减弱NF-κB信号途径及其后的炎症反应,进而抑制NF-κB对CF6的表达上调。这可能是TZDs类药物抗高血压的机制之一。
【学位授予单位】:第一军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R544.1;R543.6

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