L-精氨酸对严重腹腔感染时肠屏障功能影响的临床与实验研究

【摘要】： 目的：Ⅰ：本研究通过复制Wistar大鼠严重腹腔感染模型，观察肠黏膜上皮损伤指数、肠上皮细胞凋亡指数、测定血清一氧化氮(nitric oxide，NO)及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)水平，研究严重腹腔感染时大鼠小肠黏膜损伤程度、小肠黏膜上皮细胞凋亡数量的变化、NO介导的全身炎症反应情况，以及应用左旋精氨酸(L-Arg)后对严重腹腔感染大鼠的治疗效果。 Ⅱ：通过观察L-精氨酸增强的肠外营养对严重腹腔感染患者平均术后住院时间、术后并发症发生率、术后全身炎症反应综合征(systemic inflammation response syndrome，SIRS)评分、血清C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、血浆内毒素水平、血浆D—乳酸水平的影响；比较严重腹腔感染患者和非腹腔感染患者的血清纳米细菌(nanobacteria，NB)检出率，研究L-精氨酸对严重腹腔感染患者的治疗作用，探讨严重腹腔感染时肠黏膜屏障功能变化和纳米细菌的致病机制，阐明L-精氨酸对严重腹腔感染时肠屏障功能的影响。 方法：Ⅰ：将18只Wistar大鼠随机分为2组，每组9只：①CLP组：采用盲肠结扎穿孔法(cecal ligation plus puncture，CLP)建立严重腹腔感染模型；②ARG组：于CLP术后腹腔注射盐酸精氨酸(300mg／kg.d)。术后24h采血，留取血清，经显色后用分光光度法测定血清NO及iNOS水平；术后24h采集回肠组织标本，经固定后常规石蜡包埋、切片，经苏木精—伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，光镜下进行小肠病理学观察，检测肠上皮损伤指数；石蜡切片经末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)法显色，光镜下观察肠黏膜上皮凋亡细胞并计数各组的凋亡指数。 Ⅱ：将2005年5月～2006年1月在南方医院普外科住院的严重腹腔感染患者40例，随机分为精氨酸治疗组(n=20)和常规治疗组(n=20)。精氨酸组在常规治疗基础上添加盐酸精氨酸0.3g／(kg·d)静脉滴注，连续5天。同时选择15例非腹腔感染人群作为血纳米细菌检测对照。两组腹腔感染患者分别于术前和术后第四天采集静脉血，分析和检测：①两组患者的术后并发症发生率和平均住院天数；②SIRS评分和血清C反应蛋白；③血浆内毒素和D-乳酸水平；④血纳米细菌的培养、茜素红染色观察、扫描电镜观察，计算血纳米细菌阳性率。 所有数据均采用社会科学统计软件包10.0版(Statistical Package for the Social Science，SPSS 10.0)进行统计分析。计量资料均数用(?)±s表示，计量资料的比较采用两独立样本t检验、配对t检验、秩和检验和方差分析，对计数资料率的比较采用x~2检验，检验水准a=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：Ⅰ、严重腹腔感染大鼠模型：①术后CLP组和ARG组大鼠血清NO水平分别为：(87.2±16.7umol／L vs 79.9±18.0umol／L，t=0.881，P=0.391)，两组大鼠血清NO水平无显著性差异。②术后两组大鼠血清iNOS水平分别为：(44.4±6.6U／L vs 30.6±7.4U／L，t=4.157，P=0.001)，CLP组血清iNOS水平显著高于ARG组。③CLP组及ARG组术后均出现小肠黏膜病理损害，表现为小肠黏膜和黏膜下充血水肿；毛细血管充血；黏膜层中性粒细胞浸润；部分可见肠黏膜上皮脱落；少数可见出血与溃疡；浆膜层可见炎性渗出；测量两组肠黏膜上皮损伤指数，其分别为(4.18±0.38 vs 3.62±0.49，t=2.673，P=0.017)，ARG组小肠黏膜病理性损害显著减轻。④术后两组大鼠小肠标本均可见肠上皮细胞凋亡，凋亡细胞胞核为棕褐色，呈固缩、断片状，主要位于绒毛顶部，部分位于隐窝，检测两组标本凋亡指数分别为：(14.94±1.83 vs 12.64±2.20，t=2.414，P=0.028)，CLP组大鼠小肠黏膜上皮细胞凋亡细胞数量较ARG组显著升高。 Ⅱ、严重腹腔感染患者：①患者一般资料：精氨酸治疗组和常规治疗组两组患者平均年龄(36.55±17.55 vs 37.45±9.54，t=0.201，P=0.842)、性别构成比(x~2=0.114，P=0.736)、原发疾病构成比(x~2=0.210，P=0.995)无显著性差异。②临床指标：精氨酸治疗组和并常规治疗组发症发生率分别为：(20％vs 15％，x~2=0.173，P=0.677)；平均术后住院时间分别为：(14.45±17.83dvs 13.75±17.10d，t=0.127，P=0.900)，此二项指标无显著性差异。③肠屏障功能指标：严重腹腔感染患者血浆内毒素水平，入院时与术后第4天分别为：精氨酸治疗组(0.33±0.11 kEu／L vs 0.18±0.10kEu／L，t=8.360，P＜0.001)、常规治疗组(0.31±0.09 kEu／L vs 00.27±0.11kEu／L，t=3.457，P=0.003)；血浆D-乳酸水平，入院时与术后第4天分别为：精氨酸治疗组(4.13±0.79mg／L vs 2.77±0.75mg／L，t=9.240，P＜0.001)，常规治疗组(4.20±0.71mg／L vs 3.50±0.79mg／L，t=5.376，P＜0.001)。术后第4天，精氨酸治疗组和常规治疗组相比较，血浆内毒素水平存在显著性差异(F=20.677，P＜0.001)，血浆D-乳酸水平组间存在显著性差异(F=13.478，P=0.001)，精氨酸治疗组水平较低。④术后全身炎症反应指标：严重腹腔感染患者SIRS评分，入院时与术后第4天分别为：精氨酸治疗组(2.65±0.75 vs 0.85±0.99，t=13.077，P＜0.001)、常规治疗组(2.40±0.68 vs 1.55±1.00，t=6.474，P＜0.001)治疗后较入院时显著降低；术后第4天，精氨酸治疗组平均SIRS评分和常规治疗组比较，组间有显著性差异(F=25.417，P＜0.001)，精氨酸治疗组水平较低；术后第4天，精氨酸治疗组血清CRP分别为(27.99±21.81mg／L vs 48.18±22.23mg／L，H=5.927，P=0.015)精氨酸治疗组显著低于常规治疗组。⑤血纳米细菌检测：纳米细菌经茜素红染色后阳性标本可见桔红色颗粒，扫描电镜观察：阳性标本可见纳米细菌呈球形，部分聚集呈链状，直径约80～500nm。严重腹腔感染患者血纳米细菌检出率亦较对照组显著升高，分别为：(腹腔感染组65.2％vs对照组13.3％，x~2=9.886，P=0.002)。 结论：Ⅰ：L-精氨酸能降低严重腹腔感染大鼠血清iNOS水平，减轻严重腹腔感染时肠黏膜上皮的损伤，减少肠黏膜上皮细胞凋亡。Ⅱ：严重腹腔感染可导致患者发生肠屏障功能障碍，L-精氨酸可减轻严重腹腔感染患者全身炎症反应，维护肠屏障功能。严重腹腔感染患者血纳米细菌检出率较高，可能与肠道纳米细菌移位有关。