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妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)和游离雌三醇(uE_3)时间分辨荧光免疫诊断试剂的研制

蒋艺勤  
【摘要】: 研究背景:标记免疫学是一门综合性的边缘学科。它是集基础医学、实验医学及临床医学于一体的综合性学科。其基本原理是利用抗原抗体结合反应的特异性,加上各种标记物的易检测性和放大作用来达到检测各种微量物质,它常用于医学、农业、食品卫生、法医等多个行业。因此,利用标记免疫学原理建立的标记免疫技术具有高灵敏度、高特异性等特点,是发展最快的检验技术之一。近年来,最常用的标记免疫分析技术是放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA),酶免疫分析(Enzymatic immunoassay,EIA),胶体金免疫分析(Colloidal gold immunochromatographic assay,GICA)和化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)。但它们在应用中都存在一些固有的缺陷:RIA的放射性核素污染、标记物的货价期短;EIA酶的活性容易失活,导致EIA的灵敏度不高,酶的大分子标记容易影响被标记物的空间结构,使得EIA灵敏度的提高受到限制;GICA灵敏度不高,很多微量检测不能使用;CLIA发光底物衰减快,测定重复性差,标本不能重复测定;而用普通荧光分子作为标记物容易受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等诸多因素的干扰,导致分析的灵敏度低,现常用于免疫组化,很难适应微量抗原抗体检测的需要。20世纪80年代初发展起来的时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术,克服了上述缺点,具有快速、灵敏、稳定,无污染等特点,并广泛应用于生物医学研究和临床医学检验。它主要利用了标记物Eu~(3+)独特的荧光特性,通过时间延迟和波长分辨技术,使得强特异性荧光和背景荧光分辨开,从而消除了背景荧光的干扰,提高检测灵敏度。 妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)是一种锌离子依赖性金属蛋白酶,它是在1974年首次在妊娠妇女血中发现。它的分子量为199kDa,基因编码在第9号染色体。目前普遍认为PAPP-A是孕妇血清学产前筛查的一项重要生化指标,主要用于妊娠早期(第1期)产前筛查和动脉硬化方面的研究。如果孕妇8-14周时,PAPP-A水平较低,犯胎儿发育不良、染色体异常、早产和死胎等风险增加。PAPP-A也可以作为急性冠状动脉综合征(包括动脉粥样硬化、急性心肌梗塞、不稳定心绞痛等)的一种新的生化血清学指标。 雌三醇(E_3)是3种重要的内源性雌性激素之一,在正常人血清样品中的含量很低,女性体内雌激素水平随月经周期呈现周期性变化;对于孕妇,它的主要来源是婴儿和胎盘,且一般含量很高(超过10ng╱mL)。首先,来自母亲的类固醇在胎盘转化为孕酮,孕酮在胎儿肾上腺再转为DHEA-S,然后在胎儿肝中羟基化,最后在胎盘转化E_3。在非妊娠妇女,它主要来源雌二醇(E_2)。在体内,uE_3约占9%,结合雌三醇(cE_3)占91%。E_3在体内半衰期为(20-30)分钟。总雌三醇(tE_3)的改变能引起uE_3的迅速改变。测定uE_3比测tE_3有更多有优点,因为uE_3的水平不受肝病和母亲的肾脏影响,也不受抗生素的影响。它更能准确的反应胎儿发育的情况,况且uE_3也更易于检测。 目的:在建立PAPP-A双抗体夹心和uE_3的竞争抑制时间分辨荧光免疫分析法的基础上,研制其TRFIA定量诊断试剂,并与市售的PerkinElmer(以下简称PE)公司时间分辨免疫测定试剂盒进行比较。 方法:采用固相双位点抗体夹心法(一株单克隆抗体用于包被微孔反应板,另一株用于标记Eu~(3+)螯合物)和固相第二抗体包被的竞争抑制法分别建立PAPP-A和uE_3时间分辨荧光免疫分析法,继而研制其定量诊断试剂。 1.包被与封闭:用碳酸盐缓冲液将包被抗体稀释成不同浓度后,200μL/孔加入微孔反应板中,于4℃16 h,倾去包被液,加入封闭液,250μL/孔,4℃封闭24 h,倾去封闭液,洗涤后真空抽干,-20℃保存。 2.E_3-BSA完全抗原的制备先利用溴乙酸(bromoacetic acid)和雌三醇合成雌三醇-3-羧甲基醚(E_3-3-CME),再利用N-羟基琥珀酰胺(HOSu)和碳二亚胺(EDC)将E_3-3-CME活化为活泼酯,然后与BSA偶联获得完全抗原E_3-BSA。 3.抗体抗原的Eu~(3+)标记:将0.5 mg待标记物加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中,5000 rpm离心3 min。再用标记缓冲液重复洗涤6次。将200μL标记抗体和0.5 mg铕标记试剂充分混匀,4℃过夜。 4.Eu~(3+)标记物的纯化标记完成后过Superdex 200层析柱分离纯化,洗脱液洗脱,同时收集流出液,逐管测量吸光度(A280 nm),合并峰管确定蛋白含量,以PE公司标记试剂盒中的Eu~(3+)标准测定合并峰管的Eu~(3+)浓度。求得标记率和蛋白回收率。 5.参考标准品的制备用含0.2%BSA,0.1%NaN_3的Tris-Hcl缓冲液将PAPP-A抗原配制成0、10、40、200、800和2000 U/mL,E_3抗原用去激素血清配制成1,4,12,40,180nmol/L系列标准溶液,每瓶1ml分装冻干,-20℃干燥保存。 6.操作程序PAPP-A操作程序:微孔板上每孔依次加入50μl参考标准品或1:5稀释的样品,再每孔加入1:50稀释铕标抗体100μl,25℃振动孵育1.5 h,用洗涤液冲洗6次,每孔加入200μl增强液振动孵育5 min后在Auto-Delfia1235荧光检测仪上检测荧光值。uE_3操作程序:微孔板上依次加入50μl参考标准品或样品,再每孔加以分析缓冲液1:75倍稀释的铕标记E_3完全抗原200μl,振动37℃孵育1.5 h。用洗涤液冲洗6次。每孔加入200μl增强液振摇5min后在Auto-Delfia 1235荧光检测仪上检测荧光值。 7.试剂性能指标的评价(1)灵敏度:以零参考标准品(A点)作为标本测量20次,计算其荧光均值及标准差。以A点荧光值测定值的均值加上(或减去)2倍的标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度为其灵敏度;(2)准确性:计算质控血清的回收率;(3)精密度:按PAPP-A和uE_3的操作程序,测定自制质控血清,各设8个复孔。计算各质控血清检测值的均数、标准差及CV值;(4)特异性:将干扰物质当作标本稀释至一定浓度进行测定;(5)稳定性:将自制试剂分别放置于4℃3个月,37℃放置7天后,测试稳定性;(6)相关性:标本用自制试剂与国外试剂同时检测后进行相关性的比较。 结果:PAPP-A-TRFIA试剂的灵敏度为1.2 mIU/L,线性范围为6-10000mIU/L,回收率为97.9%。分析内和分析间变异系数(CV%)分别为2.30%-4.37%和2.41%-4.79%。与甲胎蛋白、胎盘催乳素、绒毛膜促性腺激素的交叉反应率分别为0.071%、1.409%和0.727%。稳定性试验显示自制PAPP-A-TRFIA试剂可以在4℃稳定3个月,37℃稳定7天。31份血样用本试剂与进口的同类试剂同时检测,其相关系数为0.991。 uE_3-TRFIA试剂的的灵敏度为0.20nmol/L,线性范围为0.20-180nmol/L,回收率为107.6%。分析内和分析间变异系数(CV%)分别为1.33%-3.53%和0.58%-5.95%。与E_2、孕酮和睾酮的交叉反应率分别为0.24%、0.36%和0.40%。稳定性试验显示自制uE_3-TRFIA试剂可以在4℃稳定3个月,37℃稳定7天。149份血样用本试剂与进口的同类试剂同时检测,其相关系数为0.925。 结论:PAPP-A-TRFIA和uE_3-TRFIA试剂的各项性能指标(灵敏度、精密度、特异性、稳定性、准确性)均达到临床检测要求,可用于临床血清uE_3和PAPP-A水平的测定,并且可替代国外同类产品。


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