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《南方医科大学》 2007年
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Velcade(bortezomib)诱导K562细胞凋亡的基因表达谱研究

孟伟  
【摘要】: 蛋白酶体存在于所有细胞的酶复合体中,它对细胞周期,血管形成,细胞粘着,细胞因子生成,细胞凋亡等过程中的蛋白质降解起着非常重要的作用。许多依赖于蛋白酶体功能的生物过程可以促进癌细胞的生长和生存。Velcade是一种有效的,可逆的蛋白酶体抑制剂。蛋白酶体抑制剂通过阻断正常细胞的生物功能促进凋亡。非临床数据证实癌细胞对蛋白酶体抑制作用比正常细胞敏感。由于Velcade对蛋白酶体抑制的可逆性,正常细胞可以从它的抑制作用后恢复,而癌细胞则趋向凋亡。 Velcade(Bortezomib)又称PS-341,MLN341和LDP-341。它已经通过了包括美国和英国在内的40个国家的批准,现授权于美国千年药厂生产股份有限公司生产,化学名为二肽硼酸(dipeptidyl boronic acid)。Velcade是一种水溶性物质,pH值为2~6.5,分子量为384.3,分子式为C_(19)H_(25)BN_4O_4。它可以选择性地抑制蛋白酶小体的苏氨酸蛋白酶活性,减少对特定细胞周期调节蛋白(IkB、p53、p27、p21等)的降解。由于这些调节蛋白的集聚,肿瘤细胞分裂周期受到干扰,细胞分裂停止,最终导致细胞凋亡。 本课题首先从形态学方面观察了Velcade处理后K562细胞的变化,然后进一步分析了K562细胞基因表达的改变。寻找差异基因的方法有很多种,如差异显示技术、代表性差异分析、抑制性消减杂交、基因芯片等。其中基因芯片是近年来发展起来的一门新的基因分析技术,尤其是表达谱基因芯片,可对基因表达情况进行全面、快速、敏感、高效的分析,因此本课题选用表达谱基因芯片作为研究工具。 我们采用光镜、DNA片段化检测等方法,观测了Velcade处理后正常K562细胞的各种变化。提取两组细胞的基因组DNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。在光镜下观察Velcade处理后的K562细胞,发现细胞增殖被部分抑制,有的细胞体积变小、变形,细胞核浓缩,但细胞膜完整。DNA片段化检测结果显示Velcade处理组细胞DNA电泳条带呈典型的梯状条带,表明细胞出现凋亡。研究发现Velcade可以有效地抑制K562增殖,使细胞增殖进程受阻,并可导致部分K562细胞凋亡。 运用基因芯片技术,检测了Velcade处理后K562细胞的基因表达谱变化。首先提取对照组和Velcade处理组K562细胞的总RNA,采用Agilent BioAnalyzer2100进行RNA样品的质量鉴定。采用Agilent低RNA荧光线性扩增试剂盒对样品进行双色荧光标记:总RNA逆转录合成cRNA,以Cy3标记对照组K562细胞,Cy5标记Velcade处理组K562细胞,合成荧光标记的cRNA,并对标记的cRNA进行纯化。纯化后的样品和Agilent Human 1A60mer寡核苷酸基因芯片进行杂交,杂交完毕后依次用漂洗缓冲液进行芯片的漂洗。然后采用Agilent基因芯片扫描仪扫描,扫描后的数据采用Feature Extraction软件进行数据采集及标准化处理。然后采用Panther数据库对差异表达基因进行生物学功能分析。最后采用半定量RT-PCR对有进一步研究价值且表达改变显著的基因Nras、Etv6进行验证。在芯片22153个检测点中,发现共同差异表达基因640个,其中29个基因表达上调。RT-PCR结果表明与芯片杂交结果基本一致。Velcade处理后K562细胞基因表达谱的变化为:致癌基因表达下调。基因表达的总体变化趋势是促进凋亡、抑制增殖。 综上所述,本研究采用Velcade处理K562细胞,DNA片段化检测等手段,观测了KS62细胞的变化。研究表明,Velcade可以抑制K562细胞增殖,并诱导部分K562细胞凋亡。研究进一步结合基因芯片技术,针对Velcade处理后K562细胞的基因表达谱进行研究,发现640个基因表达改变,其中29个基因表达上调,611个基因表达下调,表达谱的总体变化趋势是促进凋亡、抑制增殖。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q343

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【参考文献】
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