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5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对耐药/非耐药人鼻咽癌作用的实验研究

杨小民  
【摘要】: 鼻咽癌高发于我国南方,目前主要治疗方法包括:放疗、化疗、手术,但局部复发和远处转移是治疗失败的主要原因,化疗是最主要的辅助治疗手段,然而肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性(MDR)使鼻咽癌的治疗变得更加困难,需要探索直接针对多药耐药肿瘤细胞的新技术。光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是一种新兴的肿瘤治疗方法,利用肿瘤组织选择性摄入特定的化学物质,在一定波长的光作用下产生光动力效应而达到破坏肿瘤组织的目的。因为光敏剂优先积聚在肿瘤部位,有可能杀伤多药耐药的肿瘤细胞,光动力对于多药耐药肿瘤是一种可供选择的治疗手段。 PDT的核心是光敏剂,目前临床上广泛应用的光敏剂是血卟啉衍生物(HPD),虽然在肿瘤的临床诊断和治疗中都取得了肯定的疗效,但仍有很多不足之处:作用光谱不理想;对组织的穿透能力较差;给药至光照的时间间隔长;用药前需皮试;价格昂贵;特别是皮肤光敏副作用较大,可持续到治疗后六周。5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是目前光动力学疗法领域中最活跃的光敏剂前体物,它因能够有效地通过外源加入的方式,在肿瘤细胞中生成光敏剂原卟啉(PpⅨ)而在PDT领域独树一帜。由5-ALA引起的皮肤光致敏作用只需两天就可以消除,且价格便宜,能够口服用药,因此,5-ALA以局部或全身给药的方式被广泛用于治疗皮肤癌、食道癌等肿瘤。 5-ALA-PDT用于鼻咽癌治疗起步较晚,本课题拟从四个方面进行相关研究,第一部分通过观察5-ALA-PDT对体外培养人鼻咽癌细胞株CNE2及其顺铂耐药株CNE2/DDP的生物作用,探讨光动力治疗鼻咽癌及多药耐药鼻咽癌的可行性。第二部分通过观察5-ALA-PDT对荷耐药、非耐药鼻咽癌裸鼠的肿瘤体内杀伤作用,为临床应用PDT治疗鼻咽癌提供理论支持和实验依据。第三、四部分探讨光动力杀伤耐药、非耐药鼻咽癌的机制及多药耐药调节剂维拉帕米是否对5-ALA-PDT杀伤耐药鼻咽癌具有增效作用,为鼻咽癌综合治疗提供参考。 第一部分5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对人鼻咽癌耐药/非耐药细胞体外作用的实验研究 目的:通过观察5-ALA-PDT对体外培养CNE2及CNE2/DDP细胞的生物作用,探讨光动力治疗鼻咽癌及多药耐药鼻咽癌的可行性,及最佳用药剂量、用药时间、最佳激光剂量等。 1.方法: 1.1 CNE2或CNE2/DDP细胞生物学特性检测: 细胞形态学观察;流式细胞术分析CNE2或CNE2/DDP的细胞周期、检测P-gP、ABCG2表达及细胞荧光物质罗丹明排出;MTT法检测CNE2或CNE2/DDP细胞对顺铂、长春新碱、5氟尿嘧啶三种化疗药耐药指数。 1.2共聚焦显微镜下观察PpⅨ在CNE2和CNE2/DDP细胞内定位。 1.3流式细胞术或荧光分光光度计检测不同孵育时间、不同5-ALA浓度对CNE2或CNE2/DDP细胞内光敏剂PpⅨ的荧光强度的影响。 1.4 MTT法测定不同5-ALA孵育时间及其介导PDT对CNE2或CNE2/DDP细胞细胞存活率的影响。 1.5 MTT测法定不同5-ALA浓度及其介导PDT对CNE2或CNE2/DDP细胞细胞存活率的影响。 1.6 MTT法测定不同激光能量PDT对CNE2或CNE2/DDP细胞存活率的影响。 2.结果: 2.1细胞生物学特性检测结果 CNE2胞体较大,胞浆亮,在培养瓶中分布及生长均匀;CNE2/DDP胞体相对较小,圆形,在培养瓶中常常呈现分片聚集现象。 CNE2/DDP的G_0/G_1期细胞较CNE2明显增多,而S期细胞显著减少;CNE2/DDP对DDP、5-Fu、VCR三种药物耐药指数分别为24.56、224.21和52.65;CNE2/DDP、CNE2细胞P-gP、ABCG2表达率分别为(75.84±1.14)%、(2.78±0.70)%和(54.96±1.20)%、(2.75±0.55)%;CNE2/DDP细胞内罗丹明荧光强度远低于CNE2细胞(2.98vs243.6) 2.2共聚焦显微镜观察CNE2或CNE2/DDP细胞内PpⅨ主要弥散地分布在细胞的胞膜、胞浆中,而细胞核中少见分布。 2.3 CNE2或CNE2/DDP胞内PpⅨ的荧光强度表现为对5-ALA共孵育时间、5-ALA浓度的量效依赖关系,但当孵育时间达6h、5-ALA浓度为0.5-1.00mmol/L时出现了饱和现象。在相同条件下,CNE2细胞胞内PpⅨ荧光强度均显著高于相应CNE2/DDP细胞。 2.4 CNE2或CNE2/DDP细胞存活率与5-ALA和细胞的共孵育时间、5-ALA浓度、激光能量呈负相关,但当孵育时间为6小时、5-ALA浓度1.0或0.5mmol/L,激光剂量为40J/cm~2时,CNE2或CNE2/DDP细胞存活率进入平台期,继续延长孵育时间,提高5-ALA浓度或增加激光剂量并不能显著降低CNE2或CNE2/DDP细胞存活率。 相同条件下,CNE2细胞存活率明显低于CNE2/DDP细胞。5-ALA与CNE2或CNE2/DDP孵育6 h、激光剂量为40J/cm~2条件下,5-ALA浓度为1.0mmol/L、0.5mmol/L时,5-ALA-PDT分别对CNE2和CNE2/DDP细胞产生充分的杀伤作用。 单用不同浓度的5-ALA或单用不同剂量激光辐射对CNE2和CNE2/DDP细胞存活率无影响。 3.结论: 3.1两株细胞生物学特性显著不同,CNE2/DDP细胞具有耐药细胞特征,是研究耐药鼻咽癌的良好模型。 3.2 5-ALA与CNE2和CNE2/DDP细胞共孵育产生PpⅨ,主要定位于胞浆、胞膜,胞核未见PpⅨ荧光。 3.3 CNE2和CNE2/DDP胞内PpⅨ荧光强度随着5-ALA的浓度的增加而增加,但在1.00mmol/L时出现饱和,在孵育6 h达高峰。 3.4 5-ALA-PDT对CNE2和CNE2/DDP细胞均具有杀伤作用:最佳孵育时间为6小时,最佳药物浓度为0.5-1.00mmol/L,最佳激光剂量为40J/cm~2。5-ALA及激光本身对细胞无明显毒性作用。 3.5在相同5-ALA浓度与激光剂量条件下,5-ALA-PDT对CNE2的杀伤作用大于CNE2/DDP,表明CNE2/DDP对5-ALA-PDT存在一定程度的交叉抵抗。 第二部分5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对裸鼠人鼻咽癌移植瘤作用的研究 目的探讨5-ALA-PDT对荷耐药、非耐药鼻咽癌裸鼠的移植瘤体内杀伤作用。 1.方法: 1.1以CNE2或CNE2/DDP细胞制备裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型。 1.2 CNE2或CNE2/DDP细胞荷瘤裸鼠分别设5-ALA-PDT组、荷瘤对照组、激光对照组、5-ALA组。 1.3分别于处理后第1、3、7、14、21天,测量四组的裸鼠肿瘤大小,计算肿瘤体积,末次测量后处死裸鼠,切除肿瘤称重并行病理组织学检查。 2.结果: 2.1以1×10~7个CNE2和CNE2/DDP细胞接种裸鼠背部,可以成功复制出裸鼠人鼻咽癌移植瘤的模型。 2.2 5-ALA-PDT对CNE2和CNE2/DDP细胞裸鼠移植瘤的作用: 第3、7、14、21天,CNE2或CNE2/DDP细胞裸鼠移植瘤的5-ALA-PDT组肿瘤体积显著小于其他三组。5-ALA-PDT处理后第7、14、21天时,CNE2/DDP裸鼠肿瘤体积均显著大于CNE2裸鼠肿瘤体积。但荷瘤对照组、激光对照组、5-ALA组三组之间相互比较无显著性差异。 CNE2或CNE2/DDP裸鼠的5-ALA-PDT组肿瘤重量明显低于各对照组,但三组对照组之间肿瘤重量无显著性差异。经5-ALA-PDT处理后,CNE2/DDP裸鼠肿瘤重量显著高于CNE2裸鼠。 2.3病理检查显示:5-ALA-PDT组肿瘤组织大片坏死及退化、变性,血窦破坏。 3.结论: 5-ALA-PDT对CNE2和CNE2/DDP细胞裸鼠移植瘤均具有治疗作用,但对CNE2裸鼠移植瘤的杀伤作用强于CNE2/DDP裸鼠移植瘤;单纯给予5-ALA或单纯给予激光对CNE2和CNE2/DDP细胞裸鼠移植瘤没有明显的抑制作用。 第三部分5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对人鼻咽癌耐药/非耐药细胞作用的机制研究 目的探讨5-ALA-PDT杀伤耐药、非耐药人鼻咽癌的作用机制。 1.方法: 1.1爬片法培养CNE2或CNE2/DDP人鼻咽癌细胞,随机分为空白对照组、单纯5-ALA组、单纯激光组、5-ALA-PDT组,使用Hoechst33258染色和、Annexin-V—PI染色检测凋亡。 1.2收集CNE2或CNE2/DDP细胞分成空白对照组与5-ALA-PDT组,行Annexin-V—PI染色流式细胞术分析。 1.3上述四组细胞行透射电镜观察。 1.4荷瘤对照组、单纯激光组、单纯5-ALA组、5-ALA-PDT组裸鼠肿瘤组织行MDA含量测定。 1.5上述四组裸鼠肿瘤组织行透射电镜观察。 1.6上述四组裸鼠肿瘤组织使用TUNEL法检测组织细胞凋亡。 1.7收集CNE2或CNE2/DDP细胞分成空白对照组与5-ALA-PDT组,采用流式细胞术分析两组细胞凋亡调节基因蛋白Bax与Bcl-2表达。 2.结果: 2.1 5-ALA-PDT对人鼻咽癌CNE2或CNE2/DDP细胞的作用 (1)Hoechst33258凋亡染色法、Annexin-V—PI染色法均发现,CNE2或CNE2/DDP细胞只有5-ALA-PDT组有细胞凋亡现象,而空白对照组、单纯5-ALA组、单纯激光组细胞无凋亡细胞。Annexin-A—PI染色法同时发现坏死和凋亡细胞。 (2)透射电镜观察发现,CNE2或CNE2/DDP细胞5-ALA-PDT组在存在大量坏死细胞的同时有部分凋亡细胞,而其它组细胞表现基本正常。 (3)Annexin-V—PI染色法流式细胞术定量分析示:CNE2或CNE2/DDP细胞5-ALA-PDT组其细胞凋亡率、坏死率、凋亡+坏死率均显著高于空白对照组。CNE2细胞坏死率明显高于CNE2/DD细胞,而CNE2/DDP细胞凋亡率则显著高于CNE2细胞。 2.2人鼻咽癌移植瘤裸鼠肿瘤组织检测 (1)荷瘤裸鼠肿瘤组织MDA测定:CNE2与CNE2/DDP裸鼠的5-ALA-PDT组肿瘤组织MDA含量显著高于其他三组高。CNE2裸鼠5-ALA-PDT组肿瘤组织的MDA含量高于CNE2/DDP裸鼠。 (2)肿瘤组织透射电镜观察:PDT组存在大量坏死细胞及部分凋亡细胞,而其他组肿瘤组织细胞表现基本正常。 (3)TUNEL法检测裸鼠肿瘤组织细胞凋亡:CNE2或CNE2/DDP裸鼠5-ALA-PDT组的凋亡指数显著高于其他相应三组对照;CNE2/DDP裸鼠5-ALA-PDT组肿瘤凋亡指数高于CNE2裸鼠5-ALA-PDT组。 2.3 CNE2和CNE2/DDP细胞的5-ALA-PDT组与空白对照组比较,Bax表达明显上调,Bcl-2表达显著下调,Bax/Bcl-2比值显著上调。 3.结论: 1.5-ALA-PDT既可以诱导CNE2或CNE2/DDP细胞凋亡,也可以通过光敏剂产生的活性氧物质杀伤肿瘤细胞。 2.5-ALA-PDT通过光敏剂产生的活性氧物质杀伤CNE2的细胞的作用可能大于诱导凋亡,而对CNE2/DDP的诱导凋亡作用似乎占据优势。 第四部分维拉帕米对5-氨基乙酰丙酸介导的光动力杀伤人鼻咽癌耐药/非耐药细胞作用的影响 目的探讨维拉帕米对5-ALA-PDT杀伤耐药、非耐药鼻咽癌是否具有增效作用。 1.方法 1.1流式细胞仪检测VER对与5-ALA共孵育的CNE2或CNE2/DDP细胞内PpⅨ荧光强度的影响 1.2荧光分光光度计法检测VER对与5-ALA共孵育的CNE2或CNE2/DDP细胞内PpⅨ荧光强度的影响 1.3 MTT法检测VER对5-ALA-PDT杀伤CNE2或CNE2/DDP细胞作用的影响,设空白对照组、VER组、5-ALA组和5-ALA+VER组。 2.结果: 2.1 CNE2/DDP细胞5-ALA+VER组在各5-ALA浓度条件下,细胞内PpⅨ荧光强度显著高于5-ALA组,CNE2细胞内PpⅨ荧光强度有不同程度增加,但无显著性意义。 2.2 CNE2/DDP细胞5-ALA+VER组在各5-ALA浓度条件下,细胞存活率明显低于5-ALA组;CNE2细胞5-ALA+VER组细胞存活率与5-ALA组相比,差异无显著性。 3.结论: 3.1维拉帕米可显著增强CNE2/DDP细胞内PpⅨ荧光强度,而对CNE2细胞内PpⅨ荧光强度无明显影响。 3.2维拉帕米可显著增强对5-ALA-PDT对CNE2/DDP细胞的杀伤作用,而对5-ALA-PDT杀伤CNE2的作用无显著影响。


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