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人骨髓间充质干细胞对新生大鼠高氧肺损伤的干预研究

田兆方  
【摘要】: 背景吸入高浓度氧常被用于多种疾病的救治,以保证组织对氧的需求,但长时间吸入高氧的同时也会引起肺结构和功能的异常,以致影响生活质量,严重者危及生命;对正在发育中的肺组织,高氧甚至会导致其不可逆的畸形发育。支气管肺发育不良是一种发生于早产儿尤其是极低出生体重儿的一种慢性肺疾病。以肺泡形成减少和微血管化异常为特征,与表面活性物质的缺乏、氧化应激、气压伤、炎症反应、肺泡纤维蛋白沉积、营养以及遗传背景等因素相关。肺泡化是一个复杂的过程,其涉及包括上皮细胞、成纤维细胞、微血管的内皮细胞等肺泡成份与细胞外的基质之间多重的交互作用。目前仍然没有一种有效的治疗方法能够逆转或减缓这种疾病的进程。 长时间的高浓度氧气吸入常引起肺部以炎症细胞浸润,细胞增殖和肥大,细胞因子及凋亡活性增加为特征的炎症反应,及随之而来的肺组织形态学改变。TNFα作为细胞因子网络的起始因子,在高氧触发的炎症反应中扮演着非常重要的角色,并与病理改变的严重性相关;在体实验已证实TNFα抑制剂可防止高氧触发的肺泡上皮细胞caspase 3的活化。TGF-β对于正常的肺泡发育是必须的,损伤和修复部位的成纤维细的积聚和活化部分是由TGF-β_1驱动的,但持续过多的TGF-β信号却在肺泡的纤维化和肺泡发育不良过程中起着关键作用。 肺泡上皮细胞和细胞外基质的相互作用对于肺的功能的完整性至关重要,细胞缝隙连接(gap junction,GJ)是缝隙连接蛋白构成的六聚合体跨膜蛋白通道结构,是广泛存在于动物组织中的一种细胞间连接形式。这些复合物偶联的细胞通过门控的轴孔连接相邻细胞的胞质成分,从而调节细胞两侧及细胞内外液体、离子、代谢产物的分布、转移及传递细胞间的信号,对机体的代谢平衡和生长发育等起重要作用。连接蛋白Connexin26(Cx26)是连接蛋白家族中的一员,研究证明Cx26存在于Ⅱ型肺泡上皮细胞中且组成Cx26/Cx32通道,在肺组织生理及损伤修复中具有重要作用。BPD的发生已被证明涉及细胞增殖,炎症反应和纤维化过程,氧化应激,感染,及微血管发育等多种机制,如针对缝隙连接在高氧肺损伤的研究将为新生动物肺损伤及修复提供新的思维。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于发育早期中胚层一类多能干细胞,具有分化为成血细胞以外的外胚层,中胚层和内胚层的实质细胞的多向分化的潜能,被称为组织工程的“种子细胞”。已有较多的研究证实来源于成体的MSCs可以归巢和/或参与肺组织的发育,从而提出基于干细胞的干预肺部疾病的疗法的可行性。先前对于干细胞移植的动物试验多采用裸鼠、NOD/SCID大鼠等,需要进行造血组织的摧毁和/或免疫抑制治疗,且移植后实验条件要求较高,对于异种间MSCs移植的免疫学方面的研究开展较少,而MSCs其低免疫原性及抑制T细胞增殖的独特免疫特性,在GVHD等方面具有潜在的临床价值。加之新生大鼠先天性免疫系统不成熟,使得其有可能成为异基因移植的受体。就干细胞的移植途径而言,静脉途径研究的最多,腹腔注射的途径比较容易实施,且有报道比其他途径更容易定植。 在本研究中,我们对正常和高氧暴露的新生大鼠采用经腹腔注射人源性MSCs的方法,探讨以新生建立异种MSCs移植模型动物的可行性、植入细胞的命运,以及对于高氧肺组织损伤的影响。体外实验中主要研究高氧对新生大鼠肺泡Ⅱ型细胞的影响及hMSCs共培养对其干预作用。本研究共分为五章: 第一章:人骨髓MSCs的分离、培养及鉴定 目的人骨髓MSCs(hBMSCs)培养、纯化、鉴定、并进行体外诱导分化为神经元样细胞。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁细胞分离法培养hMSCs,观察不同代细胞的形态;流式细胞术仪检测表面抗原CD34、CD45、CD33、CD44、CD90及HLA-DR等的表达情况;对MSCs采用二甲基亚砜、巯基乙醇及丁羟茴醚等试剂以诱导其向神经细胞分化,显微镜下观察形态变化,免疫细胞化学法对细胞爬片进行细胞鉴定。结果原代培养接种2~4h后细胞开始贴壁,24h后贴壁细胞数量明显增多,3~4h贴壁率为65%~80%,2~3d就可见一些集落形成,4~5d后集落迅速增多,10d左右融合90%以上。hMSCs呈梭形的成纤维细胞样形态,传代培养后的细胞不再以集落方式生长,而呈均匀性分布生长。流式细胞仪检查显示CD34、CD45、CD33阴性,HLA-DR阴性,CD44、CD90阳性。诱导分化试验显示诱导后1d时可见出现Nestin和NF-M阳性细胞出现,至第5d时再次检测可见Nestin阳性细胞减少,且阳性程度较前减弱。NF-M阳性细胞诱导后在第5d增多多,染色阳性程度更强。结论:成功培养出hMSCs,表面抗原标志检测为CD34、CD45、CD33阴性,HLA-DR阴性,CD44、CD90阳性,在一定条件下具有转化为神经细胞的能力。细胞重悬后加入预先包被有大鼠IgG的塑料培养瓶并置于37℃、含体积分数为5%CO_2的孵箱中培养。1h后倒出培养液,离心后弃上清,细胞重悬于加含抗生素及FBS(含体积分数为10%)的DMEM培养基,继续置于37℃、含体积分数为5%CO_2的孵箱中培养23小时。留取少许贴壁细胞贴壁细胞作透射电镜检查,细胞漂片作免疫细胞化学染色包括AKP染色及SP-A抗原染色;苔盼蓝染色检测细胞成活率。原代培养新生鼠AECⅡ放入Transwell-Clear底层上(预置盖玻片),随机分为高氧+hBMSCs共培养(A),单纯高氧组(B),空气+hBMSCs共培养(C),单纯空气组(D)等共四组,每组6复孔。A、B组置于95%O_2-5%CO_2条件下培养,而C、D组则在95%空气-5%CO_2条件下培养;24h后留取上清并换液,A、C组在Inserts中加入hBMSCs进行共培养,而B、D组则不加hBMSCs;24h后再取上清,采用ELASA法检测培养上清液中TNFα、转化生长因子β1(TGFβ1)基因的含量;Hoechst染色法检测Transwell-Clear底部AECⅡ细胞凋亡情况。免疫组化法检测Transwell-Clear Inserts中人骨髓MSC特异性SP-A的表达情况。结果倒置显微镜观察:AECⅡ细胞呈圆形或立方形,纯度高达(98±2)%,苔盼蓝拒染实验检测细胞活力为(98.15±3.12)%,透射电镜观察可见细胞内多个板层小体。每5只3日龄SD大鼠经分离纯化贴壁后可获AECⅡ细胞数平均为(90±9)×10~6。空气组细胞培养24h后,细胞形态无明显改变;高氧组细胞贴壁欠佳,折光性差,少数细胞内可见颗粒。共培养后细胞形态:相差显微镜下显示:底层细胞仍呈立方形或圆形;Inserts中的细胞初始形态圆形,渐渐变为梭形,贴附于Inserts膜上。AECⅡ免疫化学染色显示AKP阳性,SP-A阳性;Hoechst凋亡检测显示:A、B两组均可见到凋亡细胞,凋亡率分别为:4.9817±0.78617(%),7.3183±0.71692(%),而空气组均未发现细胞凋亡现象;ELISA检测显示A、B、C、D四组TNFα水平分别为共培养前51.797±10.815,55.708±11.475,21.168±3.835,21.459±4.481,共培养后则为29.501±2.169,41.458±9.765,20.822±2.605,21.429±3.448(交互效应F=19.362,p=0.000;组内效应F值=55.068,p=0.000;分组效应F值=28.253,p=0.000,);组间比较显示,共培养前,A组与B组之间差异无显著性(p>0.05),而共培养后差异均有显著性(p<0.05)。TGFβ1水平分别为共培养前2289.296±104.337,2339.0411±125.291,1337.835±149.936,1371.835±108.178,共培养后则为1683.296±112.384,2172.375±123.198,1409.441±111.994,1342.527±105.288;(交互效应F=30.711,p=0.000;组内效应F值=45.840,p=0.000;分组效应F值=129.695,p=0.000,);组间比较显示,共培养前,A组与B组之间差异无显著性(p>0.05),而共培养后差异均有显著性(p<0.05)。A、C二组Inserts中的细胞SP-A抗体免疫组化检测显示两组中均未见阳性染色细胞。结论高氧暴露导致新生大鼠AECⅡ分泌功能改变,细胞凋亡增加;而与人骨髓MSC共培养对AECⅡ的损伤具有保护作用。 第三章:新生大鼠高氧肺损伤模型的建立及缝隙连接蛋白26的相关变化 目的建立新生大鼠高氧肺损伤的动物模型,研究高氧新生大鼠肺组织结构变化及连接蛋白connexin 26(Cx26)的表达情况。方法对3日龄新生大鼠采用95%氧浓度条件下暴露7天的方法制作新生大鼠高氧肺损伤模型,观察大鼠的一般情况,HE染色法观察肺组织结构变化及辐射状肺泡计数(radical alveolar counts,RAC),电镜观察超微结构变化,免疫组织化学和原位杂交法检测Cx26蛋白及mRNA的表达情况。结果新生鼠高氧2d后活动逐渐减少,反应迟钝,但全部成活;实验后高氧组、空气组在体重、身长等方面差异有显著性;HE染色:光镜下高氧组新生大鼠可见肺肺组织结构紊乱,肺泡腔内见增多的肺泡巨噬细胞,肺间隔轻度-中度增宽,肺间质细胞增多,有多少不等的间质巨噬细胞及成纤维细胞,而对照组肺泡结构正常,肺泡间隔无水肿、炎症、纤维组织增生,肺泡腔无明显渗出。RAG值分别为:高氧组9.60±0.67,正常组14.82±1.08;t=11.62,p=0.000,差异有非常显著性。电镜病理学检查高氧组细胞间紧密连接短小或消失,部分区域内皮细胞与基底膜的连续性破坏,基底膜变薄、破坏及裸露,Ⅱ型肺泡细胞内板层小体数量减少,表面活性物质层丧失连续性,出现断裂,可见聚集成块或散落于肺泡腔,有的形成空泡;Ⅱ型肺泡上皮增生较明显,肺泡间隔成纤维细胞增生明显,胶原和弹性纤维可见。免疫组化显示Cx26蛋白在空气组表达比较局限,而高氧组弥散表达,阳性细胞比较分别为13.68±1.28%、17.82±1.72%,t=5.45,p=0.000。原位杂交示Cx26 mRNA的表达分别为10.335±1.694%、7.369±1.487%,t=3.721,p=0.002。结论成功建立新生大鼠高氧肺损伤模的动物模型,高氧可导致大鼠肺组织Cx26蛋白和mRNA表达的发生改变,并可能与其修复有密切的关系。 第四章人骨髓源性MSCs移植新生大鼠的实验研究 目的研究移植人骨髓间充质干细胞对新生大鼠的影响。方法以BrdU进行标记人骨髓来源MSCs;10日龄内清洁级SD新生大鼠24只,随机分为A、B、C三组,每组8只,A组:大剂量组,每只动物腹腔注射含5×10~4MSCs的磷酸盐缓冲液(PBS)50ul,B组:小剂量组,每只动物腹腔注射含11×10~4MSCs的PBS 50ul,C组:对照组,每只动物腹腔注射PBS 50ul。观察移植后移植物抗宿主(GVHD)一般表现,3周后处死,ELASA法检测血清TNFα;免疫组织化学检查肝脏、脾脏、肺等脏器BrdU积分情况,HE染色观察肝脏、结肠的病理GVHD分级。结果各组大鼠均未见腹泻,弓背,翘毛,精神萎靡及皮肤溃疡等表现。移植后3组大鼠在体重、血清TNFα水平等方面差异均无显著性(F=0.415,P=0.666;F=1.112,P=0.344),肝脏及结肠病理分级评分(x~2=0.793,P=0.583;x~2=1.080,P=1.080),而免疫组化显示对照组各脏器中均未见BrdU阳性染色细胞,两移植组在肺、肝脏、脾脏等中均可见均可见BrdU阳性染色细胞。尤以肺部明显,三组肺部BrdU染色积分分别为0.261±0.023,0.215±0.019;0.000±0.000(F=500.347,p=0.000),A、B两组间差异有显著性(P=0.000)。结论腹腔注射MSCs后肺、肝脏、脾脏等脏器均有MSCs定植,且与注射的MSCs量相关;新生大鼠移植人骨髓源性间充质干细胞后未发生明显的GVHD。 第五章:人骨髓来源MSCs对新生大鼠高氧肺损伤的干预作用 目的研究人骨髓来源间充质干细胞对新生大鼠高氧肺损伤的干预作用。方法采用贴壁选择法分离、培养、扩增hMSCs,并予BrdU进行标记;32只3日龄SD大鼠随机分为A、B、C、D四组,每组8只;A组:高氧+hMSCs组,B组:空气+hMSCs组,C组:高氧对照组,D组:空气对照组。A、C组:高氧(95%)暴露7天后,腹腔分别注射含5×10~4MSC的磷酸盐缓冲液(PBS)、单纯的PBS 50ul,B、D组:空气暴露7天后,腹腔分别注射含5×0~4hMSCs的PBS、单纯的PBS 50ul。3天后处死全部动物取肺组织,ELASA法检测肺组织匀浆TNFα、TGFβ1水平;免疫组织化学检查BrdU积分情况,HE染色检测RAC;RT-PCR检测Alu序列表达情况。结果四组TNFα水平分别为142.933±24.017,79.033±11.573,224.088±41.915,76.500±10.373(F=59.970,P=0.000);TGFβ1水平分别为1726.484±91.086,1530.359±173.441,2047.717±152.057,1515.777±131.049(F=24.977,P=0.000);RAC值11.145±1.331,13.941±0.985,9.595±0.672,14.819±1.080(F=43.234,P=0.000);RT-PCR检测显示A、B组均有Alu序列表达,而C、D组均未见Alu序列表达;免疫组化显示A、B组均有BrdU阳性染色细胞,BrdU积分分别为0.230±0.026,0.190±0.015,C、D组积分均为0 (F=532.763,p=0.000)。结论腹腔注射hMSC后肺组织有h MSCs定植,且与暴露的条件相关;hMSCs可改善新生大鼠因高氧引致的肺损伤。


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