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《南方医科大学》 2008年
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PRL-3对结直肠癌钙粘附蛋白相关信号通路的调节

柳玉红  
【摘要】: 研究背景和目的 结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,近十年来,结直肠癌在我国的发病率有逐年上升的趋势。转移是影响患者治疗效果和导致患者死亡的主要原因。阐明结直肠癌转移相关的分子机制及寻找预防和治疗的有效途径是目前结直肠癌研究的重要课题。 PRL-3(Phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3)属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatase,PTP)成员,是现已发现与结直肠癌转移相关的少数特异性表达分子之一。PRL-3作为肿瘤转移研究中的“魅力”基因受到广泛关注。 前期我们课题组应用酵母双杂交技术发现PRL-3新型相互作用蛋白质CDH22,并应用GST-pull down、免疫共沉淀及共定位技术进行了证实。CDH22(又称为PB-cadherin)与E-钙粘附蛋白同属于钙粘附蛋白家族经典型亚类成员。在结构上,均具有5个胞外结构域结构,除跨膜区外还具有胞内区,它们在钙粘附蛋白相关的信号通路中均起着重要作用。 由于PRL-3与钙粘附蛋白家族成员存在密切联系,本研究旨在探讨PRL-3在钙粘附蛋白相关信号分子调节中的作用。本研究先建立PRL-3稳定转染及干扰的结直肠癌细胞亚克隆,在此基础上,探讨PRL-3的过表达或敲低对结直肠癌细胞相应的生物学特性的影响,并重点探讨PRL-3与钙粘附蛋白间的功能联系,确定PRL-3参与结直肠癌转移相关钙粘附蛋白功能调节的机制,初步阐明PRL-3调节钙粘附蛋白功能的作用环节,为全面揭示PRL-3参与调节的相关信号通路提供依据。 方法 1.PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定 设计人PRL-3特异性引物,提取人结直肠癌细胞系SW480细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染结直肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR及Western blot检测PRL-3基因mRNA和蛋白的表达。 2.PRL-3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,先与pENTR~(TM)/U6线性载体定向连接,以构建pENTR~(TM)/U6真核入门表达载体。鉴定正确后,pENTR~(TM)/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iT~(TM)-DEST vector进行重组,构建pLenti6/BLOCK-iT~(TM)-DEST真核表达慢病毒干扰载体。测序证实成功构建PRL-3的慢病毒干扰载体。包装慢病毒,测病毒悬液的滴度为6×10~5 pfu/L。应用杀稻瘟菌素筛选8周后,获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系,经RT-PCR、Western blotting证实PRL-3干扰细胞克隆1及2的PRL-3 mRNA及蛋白显著降低。 3.PRL-3过表达和表达敲低对结直肠癌细胞生物学特性的影响 利用MTT法、平板克隆形成实验检测PRL-3对细胞体外增殖的影响;应用流式细胞术检测PRL-3对细胞周期的影响,应用运动小室实验检测PRL-3对结直肠癌迁移能力的影响:应用细胞粘附实验测定细胞在Ⅰ型胶原上的粘附性。 4.PRL-3对钙粘附蛋白相关信号分子的调节作用 利用Western Blot及免疫荧光法检测稳定转染、稳定干扰的细胞亚克隆钙粘附蛋白相关信号分子如E-cadherin、CDH22、a-catenin、β-catenin、γ-catenin、Snail、β-actin、β-tubulin、GSK-3β、Ezrin、Paxilin的影响。应用免疫组织化学检测裸鼠皮下成瘤组织中的E-cadherin、CK及vimentin的表达。应用GSK-3β相应的磷酸化抗体p-GSK-3β及GSK-3β抑制剂氯化锂,重点观察GSK-3β磷酸化与相关信号分子调节的关系。 结果 1.PRL-3质粒的转染及建立稳定表达PRL-3的结直肠癌细胞株 酶切及DNA测序结果表明,我们成功获得522bp的PRL-3基因编码序列并构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达。将PRL-3质粒导入SW480细胞中,挑取G418抗性单克隆,RT-PCR及Western blot确定PRL-3在转染克隆2中表达最强(命名为SW480-EGFP-PRL-3),PRL-3的空载体对照为本实验室所建立的细胞系SW480/EGFP。 2.通过RNAi技术沉默结直肠癌细胞株PRL-3表达,建立PRL-3基因稳定敲低的结直肠癌细胞株 构建了三个PRL-3的慢病毒干扰载体,慢病毒感染SW480/EGFP细胞,获得杀稻瘟菌素抗性单克隆,荧光定量PCR和Western blot结果发现PRL-3在干扰克隆1及克隆2中表达最弱(命名为SW480-PRL-3-KD1和SW480-PRL-3-KD2),其中SW480-PRL-3-KD1克隆PRL-3的干扰效率达72.9%。 3.PRL-3基因过表达及基因敲低后对结直肠癌细胞生物学特性的影响 应用MTT法,我们检测了PRL-3对SW480/EGFP、SW480-EGFP-PRL-3、SW480/EGFP/mock及SW480-PRL-3-KD1细胞体外增殖能力的影响,经析因方差分析,四组差异具有显著性(F=23.463,P=0.000);不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=71.515,P=0.000);各组细胞与各时间组两因素交互效应显著(F=2.128,P=0.008);除第1天外,其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性。经LSD法多重比较,结果表明,与SW480/EGFP/mock和SW480/EGFP细胞相比,SW480-EGFP-PRL-3细胞的增殖速度加快,而SW480-PRL-3-KD1细胞的增殖速度减慢。 平板克隆形成实验显示SW480-EGFP-PRL-3细胞克隆形成能力明显增强,而SW480-PRL-3-KD1细胞克隆形成能力显著下降,差异具有显著的统计学意义(F=44.411,P=0.000)。 粘附实验结果表明,与SW480/EGFP/mock和SW480/EGFP细胞相比,SW480-EGFP-PRL-3细胞的粘附能力增强,而SW480-PRL-3-KD1细胞的粘附能力减弱,四组差异具有显著性(F=22.013,P=0.000)。 运动小室实验证明,SW480/EGFP、SW480-EGFP-PRL-3、SW480/EGFP/mock及SW480-PRL-3-KD1细胞的运动能力,差异具有统计学意义(F=21.368,P=0.000),说明PRL-3与结直肠癌细胞的运动迁移能力有关。 4.PRL-3对结直肠癌细胞钙粘附蛋白相关信号通路中的调控作用 1) PRL-3对相关钙粘附蛋白的影响及其与上皮间叶转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生的关系 Western blot显示,PRL-3可以诱导钙粘附蛋白表达缺失。SW480细胞自身E-cadherin的表达缺如或者检测不到,PRL-3转染对E-cadherin表达效应的影响无法确定,但当我们将PRL-3基因敲低时,SW480细胞E-cadherin则恢复表达;同时我们应用间接免疫荧光技术观察到E-cadherin的表达定位于细胞膜,在少量SW480细胞与细胞间存在较弱的E-cadherin的表达,而EGFP-PRL-3转染后其E-cadherin的表达几乎不见,而PRL-3敲低后E-cadherin表达明显增强,其结果与western blot的结果一致。同时我们对前期获得的PRL-3相互作用蛋白CDH22(PB-cadherin)进行了分析,我们发现PRL-3转染可使得CDH22表达明显下降,PRL-3基因敲低CDH22的表达增加;应用问接免疫荧光技术观察到CDH22的表达定位于细胞膜与细胞浆,SW480细胞与PRL-3敲低后的细胞CDH22的表达较强,而EGFP-PRL-3转染后其CDH22的表达相对较弱。 Snail是参与上皮间叶转化的重要转录因子。Western blot结果显示,在SW480与SW480-EGFP-PRL-3细胞中,Snail的表达较强,而在PRL-3敲低的两个克隆中,Snail的表达受到抑制;Snail与E-cadherin的表达成负向关系,这与PRL-3对二者的调节也是一致的。免疫组织化学显示,裸鼠皮下成瘤组织中,上皮性标记物E-cadherin、CK在SW480/EGFP和SW480-EGFP-PRL-3瘤细胞呈较弱的表达,而在PRL-3基因敲低的SW480-PRL-3-KD1瘤细胞呈弥漫强表达;间叶性标记物Vimentin在SW480/EGFP与SW480-PRL-3-KD1瘤细胞中均未见表达,而在PRL-3基因过表达的SW480-EGFP-PRL-3瘤细胞中Vimentin在部分区域呈蔟状表达。PRL-3促进结肠癌细胞EMT的发生。 2) PRL-3对Catenin家族成员的影响 Western Blot显示,PRL-3过表达可引起β-catenin明显增加,其敲低对β-catenin的影响不明显;PRL-3基因敲低抑制了α-catenin的表达;PRL-3基因敲低可部分增加γ-catenin的表达。免疫荧光显示,β-catenin主要呈膜型表达于SW480细胞胞膜,转染PRL-3基因后,其膜型表达特征改变,膜型表达不连续,部分细胞核内有明显β-catenin聚集;γ-catenin在三种细胞中主要定位于胞膜。 3) GSK-3β磷酸化是PRL-3调节钙粘附蛋白相关信号通路的重要方式 我们观察到,PRL-3转染促进GSK-3β的表达,GSK-3β磷酸化较明显,将PRL-3基因敲低时,GSK-3β表达无明显改变,GSK-3β磷酸化明显受抑制;氯化锂可以促进GSK-3β的磷酸化而抑制GSK-3β,我们在SW480、SW480-EGFP-PRL-3、SW480-PRL-3-KD1及SW480-PRL-3-KD2等不同的细胞中,均观察到氯化锂可以促进GSK-3β的磷酸化,并且这种影响在转染EGFP-PRL-3的SW480细胞尤为明显;PRL-3转染促进snail表达增加,snail在调节上皮细胞间叶转化(EMT)中起重要作用,PRL-3敲低可抑制snail的表达,应用氯化锂处理PRL-3敲低的SW480细胞,其snail表达明显恢复;有意义的是,我们发现氯化锂处理可以恢复PRL-3敲低SW480细胞PRL-3的表达。 4) PRL-3对细胞骨架相关信号分子的影响 我们观察到PRL-3转染使得Ezrin表达减少,将PRL-3基因敲低时,Ezrin的表达略增加;PRL-3转染或敲低对于β-Tubulin的表达无明显影响;PRL-3转染后细胞内Paxillin表达减少,但在SW480-PRL-3-KD1和SW480-PRL-3-KD2两个PRL-3基因敲低的细胞中Paxillin的表达不一致。 结论 1.PRL-3基因是结直肠癌细胞增殖、粘附、迁移的促进基因; 2.PRL-3是结直肠癌细胞粘附和上皮间叶转化重要的调节因子,PRL-3通过诱导E-cadherin及CDH22表达下调促进结直肠癌细胞上皮间叶转化; 3.PRL-3通过促进细胞核内β-catenin的聚集和GSK-3β磷酸化参与钙粘附蛋白相关信号通路的调节。 本研究的创新之处: 1、构建了PRL-3过表达和敲低的相关载体,建立了PRL-3过表达和敲低的相关细胞克隆; 2、发现PRL-3参与结直肠癌细胞钙粘附蛋白相关信号通路的调节,证实PRL-3通过诱导E-cadherin及CDH22表达下调促进结直肠癌细胞上皮间叶转化; 3、PRL-3促进细胞核内β-catenin的聚集和GSK-3β磷酸化参与钙粘附蛋白相关信号通路的调节。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R735.3

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