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《南方医科大学》 2008年
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利用稳定敲低细胞模型研究PLCγ1和PKCα在胶质瘤侵袭中的机制

潘婷  
【摘要】: 神经胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤之一,占颅内肿瘤的40%~50%,治疗方法以手术加放化疗为主,但因其早期即呈侵润性生长,故预后不尽理想,恶性胶质瘤如成胶质细胞瘤患者大多(77%)在确诊后1年内死亡。肿瘤的生长需要依靠血管系统来摄取营养和代谢废物,肿瘤的侵袭和转移首先表现在新生血管的形成,这个过程包括周围基质的降解,血管内皮细胞的迁移、增殖以及管型的形成,生长因子在这一过程中发挥重要作用,他们通过直接刺激内皮细胞增殖,介导内皮细胞表达血管发生需要的关键酶或调节血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)的表达而发挥作用。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)通过参与细胞凋亡、增殖、分化作用来调节细胞生长和细胞侵袭能力,Joshua等研究证明接受表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)刺激后,神经胶质瘤细胞内及细胞间Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)增加并可持续10min,前一作用可被磷脂酶C-γ1(Phospholipase Cgammal,PLCγ1)特异性抑制剂U-73122拮抗,说明神经胶质瘤细胞内[Ca~(2+)]_i的增加依赖PLCγ1信号通路,而细胞[Ca~(2+)]_i的波动与细胞迁移和增殖相关联,细胞迁移和增殖与肿瘤侵润和远处转移相关,这些间接说明PLCγ1信号通路可以影响肿瘤侵润和远处转移。 PLCγ1受生长因子—受体复合物刺激发生酪氨酸磷酸化激活后,作为一种信号分子,在细胞生长与分化的调控中发挥重要作用。在多种肿瘤中均有PLCγ1的高表达,且其高表达与肿瘤的进展程度有关。研究表明,在神经胶质瘤细胞中PLCγ1可介导生长因子引发的肿瘤侵润信号通路,作为细胞运动调节中一个重要的分子开关,PLCγ1在神经胶质瘤的侵袭和转移中发挥重要作用,但具体信号转导方式还不十分清楚。 PLCγl激活后水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate,PIP_2)产生两种第二信使:肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1,4,5-triphosphate,IP_3)和甘油二酯(diacylglycerol,DAG),诱导钙离子释放,继而激活蛋白激酶C(proteinkinase C,PKC),从而起始下游一系列信号反应。PKC家族包含3大类,至少12种亚型,各种亚型在不同肿瘤组织及肿瘤的不同阶段中的表达各不相同。其中,在多种肿瘤的发展及恶性表型维持中PKCα/β起重要作用。有研究显示PKCα在胶质瘤细胞中高表达,并介导胶质瘤的转移与侵袭,但其具体机制不明。 在细胞静息状态下,核因子-κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)以无活性的潜在状态存在于细胞浆中,并与NFκB抑制剂IκB家族结合。当细胞受到NF-κB激活剂刺激时,与IκB家族分离,从细胞质易位至细胞核,与κB基序相结合,从而发挥转录调控作用。很多研究证实,不仅在免疫及炎症反应中,NF-κB在肿瘤侵袭与转移中亦发挥重要作用,NF-κB可以激活多种转录因子,这些转录产物对促进和维持肿瘤恶性表型起重要作用。总之,NF-κB通过诱导多种基因的表达以促进细胞增殖,调节凋亡,促进血管生成,对于肿瘤的侵袭和转移至关重要,但迄今为止,肿瘤细胞中NF-κB的激活机制仍未阐明。 我们以前的研究曾揭示,PLCγ1通过NF-κB介导结肠癌细胞系Lovo的运动和迁移。许多研究均发现,PKC家族中在细胞受到外界刺激时产生的NF-κB激活过程中起到关键作用。在B淋巴细胞中,BCR可通过PLCγ2-PKC-CARMA1-NF-κB级联介导其增殖和存活;而在内皮细胞中,TRAFs-PLC-PI3K-PKC(PKCα和PKCζ)-ROS-NF-κB这一级联介导炎症反应。这些研究成果揭示了PLC、PKC和NF-κB之间可能存在的相互作用。 本研究以人神经胶质瘤细胞株U-87MG为模型,利用细胞生物学和分子生物学及RNA干扰技术,研究了PLCγ1,PKCα和NF-κB在神经胶质瘤中的关系,以期揭示入神经胶质瘤侵袭和转移的机制并寻找相关信号通路中心调节物,为靶点新药物研发提供细胞与分子生物学依据。 首先合成DNA分子(可转录出具有干扰作用的shRNA),随后退火DNA分子成双连并将其连接至逆转录病毒载体pSUPER.retro,然后,利用脂质体将构建好的载体转染至U-87MG内,并用嘌呤霉素筛选稳定敲低PLCγ1和PKCα的细胞系。应用蛋白质印迹(Western Blot)实验对细胞中PLCγ1和PKCα的蛋白表达水平进行分析,运用凝胶电泳迁移率改变分析(Electrophoretic MobilityShift Assay,EMSA)揭示了PLCγ1、PKCα和NF-κB在神经胶质瘤内信号转导的关系。 本实验的主要结果和结论如下: 1.成功构建了人源PLCγ1 siRNA和PKCαsiRNA真核表达的重组载体,所构建的载体双酶切鉴定和DNA序列测定证明是正确的。然后重组体经脂质体转染U-87MG细胞并以嘌呤霉素筛选出了稳定表达PLCγ1 siRNA或PKCαsiRNA细胞系,分别命名:U-87/pSUPER.retro/PLCγ1-shRNA-construct(简称U-87~(PLCγ1-))和U-87/pSUPER.retro/PKCα-shRNA-construct(简称U-87~(PKCα-)),经Western Blot分析显示,与正常的U-87MG细胞和经pSUPER.retro空载体转染的U-87MG细胞相比,重组载体pSUPER.retro/PLCγ1-shRNA-construct和pSUPER.retro/PKCα-shRNA-construct在蛋白水平上显著地抑制了PLCγ1和PKCα的表达。结果表明本实验成功构建了人源PLCγ1 siRNA和PKCαsiRNA真核表达的重组载体,筛选出了稳定敲低PLCγ1和PKCα表达的细胞系,从而为进一步研究PLCγ1及PKCα在神经胶质瘤发生发展中所起的作用奠定了基础。 2.人神经胶质瘤细胞U-87MG高表达PKCα。本实验采用Western Blot,以小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞为阳性对照,验证了入神经胶质瘤细胞U-87MG细胞内PKCα的表达情况,结果显示PKCα在U-87MG细胞高表达。 3.在人神经胶质瘤细胞U-87MG中EGF引发NF-κB核转位的增加可能由PLCγ1介导。本实验采用EMSA分析得到在生理情况下U-87MG细胞核内少量存在NF-κB,受EGF刺激15min后NF-κB核转位开始增加,到60min达最高峰,该过程在敲低PLCγ1表达的U-87MG细胞内可被有效逆转,结果提示:在U-87MG细胞中EGF引起的NF-κB核转位增加可能部分依赖于PLCγ1的介导。 4.在入神经胶质瘤细胞U-87MG中PKCα可能介导NF-κB核转位的增加。本实验采用EMSA分析得到受PKC特异性激动剂(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)刺激1 5min后NF-κB核转位开始增加,到60min达最高峰,该过程在敲低PKCα表达的U-87MG细胞内可被部分逆转,此前Western Blot证实U-87MG细胞高表达PKCα,结果提示:在U-87MG细胞中PMA引起的NF-κB核转位增加可能部分依赖于PKCα的介导。 综合这些结果提示,EGF可能通过PLCγ1-PKCα信号通路介导NF-κB向核内转位,从而调控相关侵袭和转移基因的转录。为进一步研究人神经胶质瘤侵袭和转移的机制及PLCγ1和PKCα所介导的信号通路可能成为肿瘤基因治疗的靶通路提供了理论和实验依据。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R739.41

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【参考文献】
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【共引文献】
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