收藏本站
《南方医科大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

不同途径自体移植骨髓基质细胞治疗兔创伤性脑损伤

刘文鹏  
【摘要】: 创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI),是由外伤引起的脑组织损害。在交通事故伤等外伤所导致的死亡中,TBI的死亡率居于首位,严重威胁着人民的生命安全。同时,TBI的致残率也非常高,伤后多出现偏瘫失语等功能障碍,甚至持续性植物状态,给家庭和社会带来了沉重负担。因此,TBI的救治是人类社会面临的一项重要课题。 但是,目前为止,传统的治疗方法对于TBI的救治效果还不很理想。近年来,随着组织工程和成体干细胞研究的不断进展,成体干细胞移植替代受损神经细胞或神经功能的治疗方法越来越受到研究人员的重视。 骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)是成体干细胞的一种,是骨髓中除造血干细胞外的未完全分化的原始细胞,能分化成多种类型的间充质干细胞,在合适的条件下,也能跨胚层向神经细胞分化。BMSCs移植在啮齿类动物TBI模型的治疗研究证明BMSCs能够促进脑损伤的恢复。同时,BMSCs获取方便,来源充足,可进行自体移植,避免了胚胎干细胞移植所带来的伦理争议和免疫排斥反应等问题。因此,BMSCs成为治疗TBI的最理想的种子细胞之一。 目前,在成体干细胞移植治疗脑损伤的实验研究中,细胞移植的途径主要有以下几种:注射入脑实质内、注射入侧脑室内和静脉注射等,以及较少见的动脉注射,注射入腹腔内和注射入枕大池内等。经由这些途径的细胞移植,可能存在加重脑损伤、进入损伤部位的细胞数少,以及治疗效果欠佳等问题。因此,有必要寻找一条微创、进入损伤部位的细胞数多且治疗效果较理想的移植途径。 近年来,在脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)的干细胞移植治疗研究中,有研究者发现经腰穿移植的干细胞能够到达颈髓的损伤部位,且有助于神经功能障碍的修复,同时少量的细胞可以进入脑组织内。这就提示了,在中枢神经系统损伤的情况下,腰穿移植的干细胞可以迁移到相对距离较远的中枢神经系统的其他部位,也很有可能迁移到TBI部位。那么,腰穿移植也就有可能是BMSCs移植治疗TBI的一个较理想的途径。 本研究以BMSCs为移植细胞,在体外培养增殖,并以腺病毒转染绿色荧光蛋白(Adeno-virus transfected green fluorescent protein,Ad-GFP)标记,检测体外培养的BMSCs的生长特性,建立了重锤击落伤所导致的中度脑损伤兔TBI模型,并通过静脉注射和腰穿注射等途径进行BMSCs移植,在不同的时间点评估实验动物运动功能障碍的恢复情况,并于经心脏灌注固定后获取脑损伤处的病理组织,检测标记细胞,将不同途径移植治疗的效果进行比较。 第一章、原子力显微镜在体外培养的兔骨髓基质细胞和免疫球蛋白胶体金结构观察中的应用研究 目的:探索原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)在骨髓基质细胞(BMSCs)表面超微结构及生物大分子标记物检测中的作用,为BMSCs的鉴定和示踪提供更多依据,同时明确AFM在生命科学领域中的应用前景。方法:取兔股骨骨髓,密度梯度离心法获取BMSCs,以DMEM/F12培养基进行体外培养,对原代培养的BMSCs,分别在第1、7、14天以2.5%戊二醛固定15分钟,再用双蒸水清洗3次,在空气中自然晾干后,进行AFM接触模式扫描。用0.5mmol/L氯化钠溶液将免疫球蛋白胶体金(IgG-gold)原液(浓度1mg/ml)稀释至1μg/ml。再调pH值为7.0。吹打2次后,吸取10μL加到新鲜解离的云母片表面,空气中自然晾干,再用去离子水滴加表面清洗2遍,在空气中自然晾干后,室温下进行AFM接触模式扫描,以AFM自带的软件对扫描图像进行测算,并对所得到的数据进行分析校正。结果:BMSCs在不同的培养阶段都具备粘附特征,都具有相应的粘附结构,该结构位于细胞周缘,呈条纹状结构,相邻的该结构之间近乎平行,远端均插入到细胞外基质的深部。IgG-gold分子的构象为“椭圆球状”结构,其三维径线长度分别为22.0nm×9.0nm×5.7nm,分子表面积为2000±973nm~2,体积为8100±5717nm~3,表面粗糙度为1.089±0.109。结论:AFM扫描提示BMSCs的粘附特征具有相应的形态结构基础。IgG-gold分子具有均一稳定的特征性“椭圆球状”构象。AFM可以用于观察BMSCs表面的超微结构,及以纳米尺度来测定生物大分子的结构,在生命科学研究领域中有着很好的应用前景。 第二章、绿色荧光蛋白、溴脱氧尿嘧啶和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯标记体外培养的兔骨髓基质细胞的实验研究 目的:明确腺病毒转染绿色荧光蛋白(Ad-GFP)、溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU)和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)对体外培养的兔BMSCs标记的可行性,为自体移植后细胞示踪作准备。方法:通过培养HEK293细胞,经过多次传代和反复冻溶,体外扩增纯化Ad-GFP,分别以Ad-GFP、BrdU和CFSE标记体外培养的BMSCs。以免疫荧光法检测BrdU的标记率,以流式细胞仪检测Ad-GFP和CFSE的标记率。以CCK-8法检测标记后细胞的生长曲线,以流式细胞仪检测标记后的细胞周期和凋亡率。并制作重锤击落兔脑损伤模型,自体移植4周后,以4%多聚甲醛经兔心脏灌注,获取兔脑病理标本,以免疫荧光法或直接在荧光显微镜下观察脑损伤灶切片处的标记细胞。结果:BrdU的标记率为(73.3±3.6)%;GFP的标记率为(81.6±5.7)%;CFSE的标记率为(99.1±0.6)%。四组细胞均于第3d至第5d处于快速生长期,对各个时间点上的吸光度值进行t检验,提示差异无显著意义(P>0.05)。各种方法标记后的BMSCs和未标记的BMSCs相似,其绝大部分细胞(>85%)处于G0/G1期,而S期的细胞较少(<6%)。各组标记后细胞的凋亡率与未标记细胞的凋亡率相近,均较低(约3%),统计学上差异均无显著意义(P>0.05)。腰穿自体移植BMSCs 4w后,三种方法标记的细胞均可在脑损伤处发现。移植的细胞主要位于损伤灶的周缘,损伤中心很少见到细胞。对侧相应大脑皮层处未见标记的移植细胞。而在双侧侧脑室的脉络膜和室管膜处可见少量移植细胞。GFP标记的细胞位于损伤灶深缘,在荧光显微镜下,发出较强的绿色荧光。CFSE标记细胞移植的脑组织切片中,可发现临近移植细胞的脑组织也存在相对较弱的绿色荧光,这是由于CFSE渗漏所致,BrdU标记的细胞主要也位于脑损伤灶的周缘及半阴影区。结论:Ad-GFP、BrdU和CFSE均可用于标记BMSCs,对于体外培养的BMSCs的细胞周期、凋亡率和生长特性没有显著影响。CFSE标记法存在渗漏的问题,BrdU标记法的检测较繁琐,且存在假阳性的问题,而Ad-GFP标记的细胞易于检测示踪。 第三章、不同途径自体移植骨髓基质细胞治疗兔创伤性脑损伤 目的:建立一个比较稳定的兔TBI模型;明确不同途径BMSCs自体移植对于兔创伤性脑损伤的治疗效果,探索干细胞移植的微创方法,并明确是否存在最优化的移植途径。方法:实验动物随机分为5组,每组9只,以TBI后腰穿鞘内注射自体移植BMSCs组和耳缘静脉内注射自体移植BMSCs组为治疗组,以TBI后腰穿鞘内注射PBS组、正常兔腰穿鞘内注射自体移植BMSCs组和TBI后自然恢复组为对照组。BMSCs体外培养10天,并以Ad-GFP标记72h后,无菌条件下收集2×10~6个兔BMSCs,悬浮于60μl的无菌PBS溶液中。麻醉后,于兔右侧额顶部开颅,以重锤击落伤方法打击兔右侧大脑皮层运动区,打击力度为30×40g.cm,建立中度脑损伤的兔TBI模型。分别于损伤后24h,进行BMSCs自体移植,分别于移植后24h、1周、2周和4周进行兔运动功能障碍评估,并于移植后1周、2周和4周每组随机取2只兔,以4%多聚甲醛经心脏灌注固定后,取脑标本进行冰冻病理切片,并在荧光显微镜下进行细胞计数。结果:在治疗组中,运动功能障碍恢复都优于对照组,其中以腰穿移植组的运动功能障碍恢复更加明显;损伤部位细胞数由多到少依次为脑实质内移植组、腰穿移植组、对侧侧脑室内移植组和右侧耳缘静脉移植组。结论:建立了较稳定的中度脑损伤兔TBI模型。经上述途径进行的BMSCs移植均有助于TBI兔运动功能的恢复,其中腰穿移植组的效果最理想。发现了一种微创、高效移植BMSCs治疗TBI的较理想的途径。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R651.1

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 蔺铁;张相彤;;骨髓基质细胞对脑创伤大鼠神经营养因子表达水平的影响[J];黑龙江医药科学;2008年03期
2 胡猛;吕柏宁;孟刚;李坪恋;孟艳秋;;创伤性脑损伤治疗的研究进展[J];西南国防医药;2009年04期
3 顾小锋,凌诒萍,吴玥,吴长根,张维煌,马伴吟;体外培养人骨髓基质细胞的超微结构[J];上海医科大学学报;1996年03期
4 袁成良,金小岚,侯建红,栗群英,黄迎春;17β-雌二醇对骨髓基质细胞骨形态发生蛋白受体ⅠA、ⅠB mRNA表达的影响[J];中国病理生理杂志;2004年02期
5 滕晓华;卢明;刘波;潘林香;周蓉;;不同年龄大鼠骨髓基质细胞端粒酶活性及端粒长度的变化[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年42期
6 刘淑华,雷伦君,李志旺;小鼠骨髓基质细胞的辐射敏感性及某些药物对其作用的观察[J];中国医学科学院学报;1991年05期
7 赵杰,李红燕,姚程,易永林,袁春英;自体骨髓基质细胞体外扩增促进病人造血功能恢复的研究[J];武警医学;1998年06期
8 侯丽君,张敬东,卢香兰,李霞;急性髓性白血病骨髓基质细胞白细胞介素-6分泌活性的研究[J];中国医科大学学报;1999年04期
9 邓力,李冰,彭雪梅;二甲胺四环素促进骨髓基质细胞增殖作用的研究[J];华西药学杂志;1999年04期
10 董启榕,戴涟生,郑祖根;骨髓基质细胞体外增殖后移植修复关节软骨缺损的实验研究[J];中国矫形外科杂志;2000年10期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 沈健;俞康;;血宝和再障患者血清对骨髓基质细胞的影响[A];中华医学会第11届全国内科学术会议论文汇编[C];2007年
2 方希敏;李原;钱江潮;周海霞;王菊香;曾炜炜;徐霞;;正常骨髓基质细胞对HL-60细胞分化作用的初探[A];第六届江浙沪儿科学术会议暨儿科学基础与临床研究进展学术班论文汇编[C];2009年
3 丰盛梅;高建军;顾淑珠;金慰芳;;增龄过程中大鼠骨髓基质细胞PPARγ和Cbfα1表达的相关性研究[A];第七届全国老年医学学术会议暨海内外华人老年医学学术会议论文汇编[C];2004年
4 袁成良;;17β-雌二醇对骨髓基质细胞PPAR-γ2 mRNA表达的影响[A];中华医学会第三次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨骨质疏松诊断技术继续教育学习班论文汇编[C];2004年
5 童秀珍;罗绍凯;李娟;邹外一;彭爱华;张祥忠;洪文德;张国材;;系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞IFN-γ、TNF-α mRNA的表达[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
6 杨志军;罗永春;张洪钿;戴宜武;徐如祥;;Sinerem标记大鼠骨髓基质细胞及移植后活体示踪研究[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年
7 金小岚;;雌二醇对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响[A];中华医学会第三次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨骨质疏松诊断技术继续教育学习班论文汇编[C];2004年
8 杨述华;刘日光;;脱蛋白骨复合转染VEGF基因骨髓基质细胞治疗股骨头缺血坏死的实验研究[A];跨世纪骨伤杰出人才科技成果荟萃[C];2004年
9 曾东风;孔佩艳;陈幸华;常城;张曦;彭贤贵;高蕾;;阻抑HIF-1α基因表达对急性白血病骨髓基质细胞SDF-1、VEGF表达的影响[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
10 朱波;邹仲敏;罗成基;郭朝华;林远;程天民;;放射损伤后骨髓基质细胞IL-6表达的变化及其与NF-kB的关系[A];面向二十一世纪的生物医学体视学和军事病理学论文摘要汇编[C];2000年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王雪飞 张秀花;修复软骨 骨髓基质细胞是最佳种子[N];健康报;2004年
2 ;单唾液酸四己糖神经节苷脂诱导成年大鼠骨髓基质细胞成为神经前体细胞及其分化作用的研究[N];中国医药报;2003年
3 匡远深;治脑损伤可用骨髓细胞[N];健康报;2003年
4 冯友根;辛伐他汀促成骨作用研究[N];中国医药报;2004年
5 通讯员 匡远深;骨髓基质细胞移植治疗脑梗塞取得突破[N];光明日报;2003年
6 朱国旺;防治骨质疏松我们共同的责任[N];中国医药报;2002年
7 匡远深;我国一项神外基础实验研究取得成果[N];中国医药报;2003年
8 吴一福;心脏组织工程研究新进展[N];中国医药报;2004年
9 ;组织工程学研究概况(二)[N];中国医药报;2000年
10 刘则扬;护理项目的成本核算[N];健康报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王吉刚;TRAIL逆转白血病骨髓基质细胞粘附介导Jurkat细胞耐药的研究[D];第三军医大学;2005年
2 刘占川;rhG-CSF动员自体骨髓基质细胞治疗鼠局灶性脑缺血实验研究[D];吉林大学;2006年
3 金钫;组织工程骨修复牙槽骨缺损与正畸牙齿移动[D];第四军医大学;2004年
4 崔玉明;组织工程化软骨修复兔关节软骨缺损及其相关研究[D];第四军医大学;2004年
5 梁蓉;正常人骨髓成纤维样基质细胞系对急性髓细胞性白血病细胞增殖、分化和凋亡的影响[D];第四军医大学;2004年
6 朱国强;IGF-1基因转染骨髓基质细胞应用于牙周组织工程的基础与动物实验研究[D];第四军医大学;2004年
7 宋艳秋;抗VEGF靶向治疗白血病的研究[D];吉林大学;2006年
8 顾祖超;自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究[D];第三军医大学;2002年
9 赵延欣;重组人粒细胞集落刺激因子对局灶性脑缺血保护作用机制的研究[D];复旦大学;2004年
10 钟池;骨髓基质细胞静脉注射治疗大鼠短暂性局灶性脑缺血的研究[D];复旦大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李军;兔骨髓基质细胞的培养及向成骨细胞分化的实验研究[D];山东中医药大学;2004年
2 仲维广;兔骨髓基质细胞诱导成骨及与珊瑚联合培养实验研究[D];昆明医学院;2004年
3 郭伟翔;大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究[D];东北师范大学;2005年
4 高全文;VEGF基因转染的骨髓基质细胞复合磷酸钙陶瓷成骨能力研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
5 陈明;兔骨髓基质细胞附着于自体牙骨质片生长的体外研究[D];第一军医大学;2004年
6 周江;骨髓基质细胞和内皮细胞联合种植构建组织工程化骨的研究[D];四川大学;2003年
7 谷云风;RCAS1在再生障碍性贫血中的表达[D];山西医科大学;2010年
8 姜扬;静脉注射骨髓基质细胞治疗大鼠局灶性脑缺血BDNF表达的实验研究[D];中国医科大学;2005年
9 张鹏;骨碎补提取液对兔骨髓基质细胞增殖影响的实验研究[D];山东中医药大学;2005年
10 石艳玲;静脉注射骨髓基质细胞增加脑梗死大鼠血管内皮生长因子的表达[D];中国医科大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026