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《南方医科大学》 2009年
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异种抗原免疫及瘤内注射对荷瘤小鼠脾淋巴细胞免疫功能影响的研究

司晓燕  
【摘要】: 背景 机体免疫系统具有一定的识别和清除肿瘤细胞的能力已被许多实验证实,抗肿瘤免疫效应一般以细胞免疫为主,尤其是特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性在机体抗肿瘤效应中起关键作用。树突状细胞(DC)是目前已知体内抗原呈递功能最强的抗原呈递细胞(APC),CTL杀伤肿瘤细胞依赖于APC递呈肿瘤抗原。但由于肿瘤的低免疫原性以及机体对肿瘤的免疫耐受,使得肿瘤免疫治疗受到限制。研究发现肿瘤局部微环境处于免疫抑制状态,其内的细胞免疫亦存在着一个复杂的调节网络。在肿瘤患者体内,DC处于失活状态,表现为数量减少及表型和功能上的缺陷。肿瘤患者的免疫系统无法识别、杀伤肿瘤细胞,主要是由于患者体内的DC功能有缺陷,不能实现DC在免疫反应过程中有效呈递肿瘤抗原的作用。因此如何通过免疫治疗,打破免疫耐受,改善肿瘤局部免疫抑制环境,促进DC细胞递呈肿瘤抗原,有助于诱导CTL特异性杀伤肿瘤细胞活性。 目的 利用异种抗原免疫及瘤内注射的方法来治疗肿瘤,将抗异种抗原免疫反应和二次免疫应答引入肿瘤局部。通过计算脾指数、胸腺指数,测定脾淋巴细胞对S180细胞的体外杀伤率及利用免疫组化分析脾组织的CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞数量的变化,主要来了解不同处理组小鼠脾淋巴细胞的免疫功能,进而从脾免疫细胞的角度来验证此方法的可行性,并探索其机理。 方法 1、利用两种异种抗原:灭活链球菌(α-溶血性链球菌经~(60)Co机照射24小时灭活)、血型抗原(含有A型血型抗原的人A型红细胞膜成分)进行研究。 2、试验动物分组:灭活链球菌实验包括4个小组:A、灭活链球菌全身免疫及瘤内注射组;B、灭活链球菌仅全身免疫组;C、灭活链球菌仅瘤内注射组;D、空白对照组。血型抗原实验也包括4个小组:a、血型抗原全身免疫及瘤内注射组;b、血型抗原仅全身免疫组;c、血型抗原仅瘤内注射组:d、空白对照组。两个实验共8个小组,由于空白对照组D和d可以共用,因此两个实验可分为7个小组,每组6只,实验共需昆明小鼠42只。 3造模过程:前两周小鼠全身免疫4次,2次/周(A、B组小鼠每次腹腔注射浓度为0.1g/ml的灭活链球菌0.1ml/只;a、b组小鼠每次腹腔注射浓度为5mg/ml的血型抗原0.1ml/只;同时C、D、c、d组小鼠每次腹腔注射生理盐水0.1ml/只)。然后于各组小鼠背部皮下接种浓度为1×10~7个/ml的S180细胞0.1ml/只,约两周长成大小为1cm~3左右的肿块,随后连续5天瘤内注射异种抗原(A、C组小鼠每天瘤内注射浓度为0.1g/ml的灭活链球菌0.1ml/只;a、c组小鼠每天瘤内注射浓度为5mg/ml的血型抗原0.1ml/只;同时B、D、b、d组小鼠每天瘤内注射生理盐水0.1ml/只)。瘤内注射结束5天后,处死小鼠。 4、取脾及胸腺,计算脾指数及胸腺指数。 5、脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤活性测定:效靶比=20:1,在体外用MTT比色法测定不同处理组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的体外杀伤活性。 6、脾组织免疫组化分析CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞数量的变化:切脾后立即取脾组织块,常规固定、石蜡包埋、切片,行PAP法免疫组织化学染色,染色后高倍镜(10×40倍)下,分别计算每张切片中CD4、CD8阳性的细胞数。 7统计学方法:全部资料结果以((?)±s)表示,使用SPSS 13.0统计分析软件对每个实验内的4个小组进行析因设计资料的方差分析,有交互效应的固定一因素对另一因素的两水平进行t检验,最后进行单因素方差分析找出最佳组合。两个实验之间单独两组样本的均数比较采用两样本t检验。显著性水平:取a=0.05。 结果 1、灭活链球菌实验 (1)A、B、C和D组小鼠的胸腺指数分别为:2.50±1.07mg/g、1.67±0.37mg/g、2.33±1.04mg/g和2.25±0.91mg/g。灭活链球菌全身免疫与否和瘤内注射与否对胸腺指数均无显著性影响(F=0.328,P=0.573和F=1.585,P=0.223),灭活链球菌全身免疫与瘤内注射无交互效应(F=1.061,P=0.315)。四组小鼠的胸腺指数无显著性差异(F=0.991,P=0.417)。 (2)A、B、C和D组小鼠的脾指数分别为:14.42±2.63mg/g、15.83±2.28mg/g、15.28±4.51mg/g和5.67±1.31mg/g。灭活链球菌全身免疫与否和瘤内注射与否对小鼠的脾指数均有显著性影响(F=15.163,P=0.001和F=11.788,P=0.003),灭活链球菌全身免疫与瘤内注射有交互效应(F=21.342,P=0.000)。在全身免疫时瘤内注射与否对脾指数无显著性影响(t=0.995,P=0.343),无全身免疫时瘤内注射可提高脾指数(t=5.014,P=0.001)。在瘤内注射时全身免疫与否对脾指数也无显著性影响(t=0.406,P=0.693),无瘤内注射时全身免疫可提高脾指数(t=9.449,P=0.000)。四组小鼠的脾指数有显著性差异(F=16.097,P=0.000),A、B和C组的脾指数均高于D组(P值均<0.05)。 (3)在效靶比20:1时,A、B、C和D组的小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率分别为:63.17%±3.94%、10.26%±1.95%、33.30%±3.82%和9.85%±2.76%。灭活链球菌全身免疫与否和瘤内注射与否对杀伤率均有显著性影响(F=132.499,P=0.000和F=842.219,P=0.000),灭活链球菌全身免疫与瘤内注射有交互效应(F=125.308,P=0.000)。无论有无全身免疫瘤内注射均可提高杀伤率(t=29.455,P=0.000和t=12.198,P=0.000),在瘤内注射时全身免疫可提高杀伤率(t=13.330,P=0.000),无瘤内注射时全身免疫与否对杀伤率无显著性影响(t=0.302,P=0.769)。四组的杀伤率有显著差异(F=366.675,P=0.000),其中A组的杀伤率最高。 2、血型抗原实验 (1)a、b、c和d组的胸腺指数分别为:1.73±0.51mg/g、3.25±2.23mg/g、2.26±1.38mg/g和2.25±0.91mg/g。血型抗原全身免疫与否和瘤内注射与否对胸腺指数均无显著性影响(F=0.164,P=0.690和F=1.692,P=0.208),血型抗原全身免疫与瘤内注射无交互效应(F=1.768,P=0.199)。四组小鼠的胸腺指数无显著性差异(F=1.208,P=0.333)。 (2)a、b、c和d组的脾指数分别为11.60±2.61mg/g、11.78±1.58mg/g、11.86±3.62mg/g和5.67±1.31mg/g。血型抗原全身免疫与否和瘤内注射与否对小鼠的脾指数均有显著性影响(F=8.504,P=0.009和F=8.995,P=0.007),血型抗原全身免疫与瘤内注射有交互效应(F=10.125,P=0.005)。在全身免疫时瘤内注射与否对脾指数无显著性影响(t=0.147,P=0.886),无全身免疫时瘤内注射可提高脾指数(t=3.943,P=0.003)。在瘤内注射时全身免疫与否对脾指数也无显著性影响(t=0.146,P=0.887),无瘤内注射时全身免疫可提高脾指数(t=7.311,P=0.000)。四组小鼠的脾指数有显著性差异(F=9.208,P=0.000),a、b和c组的脾指数均高于d组(P值均<0.05)。 (3)在效靶比20:1时,a、b、c和d组的小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率分别为:76.27%±4.07%、10.55%±2.29%、40.92%±4.98%和9.85%±2.76%。血型抗原全身免疫与否和瘤内注射与否对杀伤率均有显著性影响(F=143.829,P=0.000和F=1036.665,P=0.000),血型抗原全身免疫与瘤内注射有交互效应(F=132.875,P=0.000)。无论有无全身免疫瘤内注射均可提高杀伤率(t=34.453,P=0.000和t=13.372,P=0.000),在瘤内注射时全身免疫可提高杀伤率(t=13.463,P=0.000),无瘤内注射时全身免疫与否对杀伤率无显著性影响(t=0.478,P=0.643)。四组的杀伤率有显著性差异(F=437.790,P=0.000),其中a组的杀伤率最高。 (4)在高倍镜下(10×40倍),a、b、c和d组的小鼠脾脏的CD4~+T淋巴细胞计数分别为:59.00±3.00、55.00±7.21、58.67±7.51和39.00±3.00,CD8~+T淋巴细胞计数分别为:41.33±4.51、23.67±2.52、32.33±1.53和23.00±3.00。血型抗原全身免疫与否和瘤内注射与否对小鼠脾脏的CD4~+T淋巴细胞数均有显著影响(F=6.335,P=0.036和F=13.301,P=0.007),血型抗原全身免疫与否和瘤内注射与否对小鼠脾脏的CD8~+T淋巴细胞数也均有显著性影响(F=7.377,P=0.026和F=57.553,P=0.000),血型抗原全身免疫与瘤内注射对CD4~+T和CD8~+T淋巴细胞数均有交互效应(F=5.828,P=0.042和F=5.482,P=0.047)。在全身免疫时瘤内注射与否对CD4~+T淋巴细胞数无显著影响(t=0.887,P=0.425),无全身免疫时瘤内注射能提高CD4~+T淋巴细胞数(t=4.214,P=0.014),在瘤内注射时全身免疫与否对CD4~+T淋巴细胞数无显著影响(t=0.071,P=0.946),无瘤内注射时全身免疫能提高CD4~+T淋巴细胞数(t=3.548,P=0.024)。无论有无全身免疫瘤内注射均可提高CD8~+T淋巴细胞数(t=5.926,P=0.004和t=4.802,P=0.009),在瘤内注射时全身免疫能提高CD8~+T淋巴细胞数(t=3.274,P=0.031),无瘤内注射时全身免疫对CD8~+T淋巴细胞数无显著影响(t=0.295,P=0.783)。四组的CD4~+T和CD8~+T淋巴细胞数均有显著性差异(F=8.488,P=0.007和F=23.471,P=0.000),a、b和c组的CD4~+T淋巴细胞数均高于d组(P值均<0.05),a组的CD8~+T淋巴细胞数最高。 3、灭活链球菌杀伤实验与血型抗原杀伤实验的结果比较:a组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率高于A组(t=5.662,P=0.000),c组小鼠脾淋巴细胞对S180细胞的杀伤率也高于C组(t=2.973,P=0.014)。 结论 1、异种抗原全身免疫及瘤内注射或仅全身免疫或仅瘤内注射,小鼠的胸腺指数均无提高。 2、异种抗原全身免疫及瘤内注射或仅全身免疫或仅瘤内注射,小鼠的脾指数均有提高,即提高了小鼠的整体免疫功能。 3、异种抗原全身免疫及瘤内注射或仅瘤内注射显著提高了小鼠脾淋巴细胞杀伤S180细胞的功能,而异种抗原仅全身免疫对小鼠脾淋巴细胞杀伤S180细胞的功能却无提高。 4、血型抗原全身免疫及瘤内注射或仅全身免疫或仅瘤内注射均能提高小鼠脾脏的CD4~+T淋巴细胞数。同时血型抗原全身免疫及瘤内注射或仅瘤内注射提高了小鼠脾脏的CD8~+T淋巴细胞数,而血型抗原仅全身免疫对CD8~+T淋巴细胞数却无显著影响。 5、血型抗原全身免疫及瘤内注射或仅瘤内注射提高小鼠脾淋巴细胞杀伤S180细胞功能的能力比灭活链球菌全身免疫及瘤内注射或仅瘤内注射更强一些。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R73-3

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