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钙信号参与中性粒细胞极性化过程的研究

赵东亮  
【摘要】: 研究背景 嗜中性粒细胞(PMNs)是具有定向移动功能的吞噬细胞,在抵抗细菌和真菌感染的宿主反应中起着重要的作用,这种功能是依靠趋化能力来实现的,趋化性是细胞感受信号分子从而具有的定向移动的能力,中性粒细胞能够沿着趋化物浓度梯度定向迁移到急性炎症的位置,这种迁移是中性粒细胞的核心功能。中性粒细胞能够迁移的基础在于其具有接受趋化刺激时具有形成极性化形状的能力。 Ca~(2+)信号在细胞的信号传导和执行功能等各个方面都发挥着重要的作用,影响着从卵子受精到细胞凋亡的整个生命过程。Ca~(2+)的独特性质在于其既能充当第一信使也能充当第二信使;既能调控细胞的生命过程,又能进行自身的调控。胞外Ca~(2+)浓度常超过10~(-3)M,而胞内至少低于胞外四个数量级之多(10~(-7)M),细胞这种Ca~(2+)稳态的维持依靠一些重要的调节区域通过一系列精妙的方式进行严密的控制和调节。在细胞膜或细胞器膜上,一些蛋白质形成的离子通道,其主要功能是通透Ca~(2+),这些离子通道依据门控机制分属于三组:电压门控性通道、配体门控性通道和库作性钙离子通道(Store-operated channels)。 1986年James Putney提出了库作性钙内流(SOCE)的概念。一组选择性刺激可以诱发细胞的应答,激活细胞表面受体从而诱导了胞膜磷酸肌醇的水解。通过磷脂酶C(PLC)产生活动性钙信号Inositol 1,4,5-trisphosphate[Ins(1,4,5)P3],从内质网(ER)钙库释放钙离子。同时,钙离子的释放伴随着外钙的内流。由于胞外钙离子的内流是由胞内钙库钙离子的释放倾空引起的,所以称为库作性钙内流。SOCE已经发现并提出多年,但其机制一直不甚清楚。最近研究发现可能与内质网膜上分布的感受分子Stiml和胞膜上的Orail等分子相互作用有关。随着人们对SOCE机制认识的逐渐发展,研究SOCE机制的工具药也逐渐受到人们的重视,其中普遍使用的有SKF96365和2-APB。 中性粒细胞在受到趋化剂刺激后发生极性化的过程中,胞内Ca~(2+)浓度和分布会发生一系列改变。PMNs趋化剂甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)可以激活内质网膜上IP3受体从而诱导内质网Ca~(2+)库释放钙离子。内质网Ca~(2+)库释放可以激活SOCE通路,促进外钙的内流。但SOCE机制是否参与中性粒细胞极性化过程以及在此过程中起何种作用,阻断SOCE后对中性粒细胞极性化过程以及趋化性有何影响,尚无确切报道。 SOCE在细胞极性化过程中可能起着重要的作用,而且这种作用可能与胞膜上脂筏(Lipid raft)结构存在密切的关系。脂筏的关键功能是它们能够作为信号的平台。为了进一步理解SOCE和脂筏的关系,我们观察了mβCD(甲基-β-环糊精,Methyl-β-cyclodextrin)对中性粒细胞极性的影响。mβCD能够清空中性粒细胞胆固醇,破坏脂筏完整性,从而可能影响到极性的形成过程。 目的 本实验通过研究中性粒细胞极性化过程中胞内Ca~(2+)信号的变化,以及应用工具药作用于SOCE机制后对细胞极性和趋化性的影响,探讨SOCE机制在中性粒细胞极性化过程中的作用。 方法 1.采用重复梯度密度离心的方法(Percoll非连续密度梯度离心法),急性分离并纯化健康成人静脉血中性粒细胞,分离纯化后的中性粒细胞进行4℃温度预处理备用。 2.使用激光共聚焦显微镜,观察不同处理因素下加入趋化剂fMLP时中性粒细胞胞质内Ca~(2+)瞬间动态变化,以确定SOCE机制是否参与中性粒细胞极性化过程。根据处理因素不同分为四组:空钙组(细胞外液使用无钙HEPEs液)、正常钙组(细胞外液使用含有1mM钙离子的HEPEs液)、高钙组(细胞外液使用含有2mM钙离子的HEPEs液)和2-APB组(细胞外液使用含有1mM钙离子的HEPEs液并使用SOCE阻断剂2-APB 100nM孵育15分钟)。 3.使用膜片钳,全细胞模式电压钳下,在不同protocol下记录不同药物预处理后加入趋化剂时全细胞电流的变化。以观测在中性粒细胞极性过程中SOCC通道电流是否参与,从而进一步确定SOCE机制是否参与中性粒细胞极性化过程,以及SOCE机制在中性粒细胞极性化过程中的作用。根据处理方法不同分组,分别为:Control组(对照组,不使用任何药物预处理,其后也不加入趋化剂fMLP)、fMLP组(不使用任何药物预处理,其后和实验组以相同方法加入终浓度为100nM的趋化剂fMLP)、SKF96365组(使用SOCE阻断剂SKF96365 10μM孵育15分钟后,加入终浓度为100nM的趋化剂fMLP)、2-APB组(使用SOCE阻断剂2-APB 100nM孵育15分钟后,加入终浓度为100nM的趋化剂fMLP)和TG组(使用内质网钙库倾空药物TG100nM孵育15分钟后,加入终浓度为100nM的趋化剂fMLP)。 4.采用流式细胞术,观察不同药物处理下加入趋化剂后,中性粒细胞极性化过程中标志性蛋白分子——极性相关骨架蛋白(F-actin)的免疫荧光变化。以观察SOCE阻断剂SKF96365、2-APB和内质网钙库倾空剂TG对细胞极性变化的影响,从而确定SOCE机制在中性粒细胞极性化过程中的作用。根据文献选择在加入趋化剂fMLP后0s(即不加fMLP)、10s、30s、60s、120s和240s这6个时间点内比较各个时间点不同组间的F-actin免疫荧光的变化差异。分组方法基本同膜片钳实验分组方法。 5.采用Transwell方法,观察不同药物处理后中性粒细胞的趋化性,分析SOCE机制和脂筏在中性粒细胞趋化过程中的作用。小室下室放入含fMLP 100nM的RMPI1640 300μL,上室加入经不同药物处理后的中性粒细胞悬液100μL[分别经TG 100nM(TG组),2-APB 100nM(2-APB组),SKF96365 10μM(SKF96365组)和mβCD 10mM(mβCD组)处理,37℃,5%CO_2孵箱内孵育15分钟],并设fMLP对照组(上室加入DMSO,剂量同溶解上述药物所用量,即fMLP组)。同时设空白对照组(上室加入DMSO,下室加入PBS液,剂量同溶解上述药物所用量,即Control组)。 结果 1.空钙组加入100nM fMLP后中性粒细胞胞内Ca~(2+)荧光值变化标准化比值显著小于正常钙组(n=9,P=0.027)。2-APB组中性粒细胞胞内Ca~(2+)荧光值变化标准化比值显著小于正常钙组(n=9,P=0.005)。 2.正常状态下中性粒细胞,加入终浓度100nM fMLP后,全细胞内向电流开始明显增加。持续一分钟之后缓慢下降并持续很长一段时间。经SKF96365 10μM、2-APB 100nM孵育15分钟后加入终浓度100nM fMLP,全细胞内向电流的增加(以钳制电位为-80mV时为例)显著被抑制(在step protocol下分别为P=0.004和P=0.022;在ramp protocol下分别为P=0.030和P=0.043)。经内质网钙库倾空剂TG 100nM孵育15分钟后,全细胞内向电流显著增大(在step protocol下为P=0.002;在ramp protocol下为P=0.002),加入终浓度100nM fMLP后全细胞内向电流增加不明显。 3.在fMLP作用240秒的时间点内2-APB预孵育组F-actin荧光值显著小于fMLP组(P=0.036),各时间点内SKF96365预孵育组和2-APB预孵育组胞内F-actin荧光值的均值均小于fMLP组。 4.2-APB预孵育组中性粒细胞趋化迁移能力显著小于fMLP组(P=0.034),SKF96365和mβCD预孵育组中性粒细胞趋化迁移率标准化比值均数小于fMLP组。 结论 1.中性粒细胞经趋化剂fMLP处理后,胞内钙离子浓度的升高包含两部分来源,即胞内钙库的钙离子释放和胞外钙离子的流入。fMLP诱导的中性粒细胞极性化过程中胞外钙离子的流入主要是通过SOCC通道完成的。SOCE机制在fMLP诱导的中性粒细胞极性化过程中胞外钙离子的流入过程中起重要作用。 2.中性粒细胞极性化过程中,SOCC通道占有重要地位,SOCE机制起了重要作用。同时可能存在其它钙离子通道和钙离子内流机制参与了中性粒细胞的极性化过程。 3.SOCE参与了中性粒细胞极性化过程,并在其中起关键性作用,阻断SOCE机制可以抑制中性粒细胞的极性化过程。 4.SOCE机制在中性粒细胞趋化迁移过程中也起重要作用,阻断SOCE可以严重影响到中性粒细胞的趋化迁移能力。同时,中性粒细胞的趋化迁移过程与脂筏密切相关,破坏细胞膜脂筏的完整性也可以影响到中性粒细胞的趋化迁移能力。在中性粒细胞趋化迁移过程中,SOCE是否与脂筏密切相关仍需要进一步实验确定。


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