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《南方医科大学》 2009年
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蜕皮甾酮促进人表皮干细胞增殖的初步研究

李国芳  
【摘要】: 1背景 蜕皮甾酮(Ecdysterone,EDS)是蜕皮激素中最主要的两种之一。蜕皮激素是调控昆虫蜕皮过程的激素,最早为昆虫学家所研究。它不仅存在于昆虫蜕皮过程中,也存在于昆虫的其他生理竹律变化时期,在低等植物厥类、裸子植物、被子植物中等众多植物类群中也有存在,并且其含量远高于昆虫,在哺乳动物甚至人类某种情况下也有发现。其对无脊椎动物体,尤其对节肢动物的生长发育、蜕皮和生殖发挥重要的作用。 蜕皮激素在脊椎动物中也是必需的物质。研究表明,蜕皮激素能促进核酸及蛋白质合成、调节糖代谢、促进脂肪代谢、调节基因表达、改善免疫功能、影响中枢神经、心血管系统、促进细胞增殖、分化等,因此被认为有“更生诱导物质(revive inducer)”的作用。 在前期的研究中本课题组发现自制的以蜕皮甾酮为有效成为的软膏能够促进兔全层皮肤创面愈合,表现为创面愈合率较高,愈合速度较快,愈合质量较好,显微镜下表现为毛细血管密度较高,并根据创面愈合率绘制出量效分析曲线。创面愈合是机体通过自身的再生能力,为恢复其表面的连续性和完整性、维持内环境稳定所进行的一系列修复活动,主要包括肉芽组织增生、创面再上皮化及瘢痕形成与创面愈合改建等一系列复杂的生物学过程。内皮细胞、上皮细胞及成纤维细胞等细胞的增殖是形成肉芽组织的关键,因此也是创面愈合的关键。表皮干细胞在创面再上皮化过程中是各层表皮细胞的源细胞,正常情况下表皮细胞的更新主要是由基底部的干细胞向上增殖分化来完成。结合创面再上皮化在创面愈合中的作用,我们推测蜕皮甾酮能促进表皮干细胞的增殖,该促进作用是可能是其促进创面愈合的机制之一。此外,目前用于促进创面愈合的外用药主要以抗炎、止血、保护创面为主,而对真正体现伤口愈合速度的促进细胞增殖的作用较小。故我们设计本研究,旨在通过观察蜕皮甾酮对人表皮干细胞增殖的影响,深入探讨其促进创面愈合的机制,为本课题组在前期研究中发明的以蜕皮甾酮为主要有效成分的促愈乳膏应用于临床提供更深入的理论依据。 2目的 通过观察蜕皮甾酮对人表皮干细胞增殖的影响,深入探讨其促进创面愈合的机制,为我们在前期研究中发明的以蜕皮甾酮为主要有效成分的促愈乳膏应用于临床提供更深入的理论依据。 3方法 采用中性蛋白酶-Ⅳ型胶原黏附法分离正常人包皮表皮干细胞,免疫细胞化学法检测第3代细胞β1整合素、角蛋白19、角蛋白14、角蛋白10表达以鉴定表皮干细胞。实验用第3代细胞。实验共分6组,5个处理组的细胞分别用蜕皮甾酮浓度为10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L的Epilife培养基培养;同时对照组的细胞用不含有蜕皮甾酮的Epilife培养基培养。分别于蜕皮甾酮作用后1d、2d、3d、4d时用MTT(3-(4,5-二甲基-2噻唑)-2,5二苯基溴化四唑)法检测酶标仪上490nm下的吸光度,判定蜕皮甾酮对人表皮干细胞增殖的影响。另外,蜕皮甾酮作用4d时采用流式细胞技术检测对照组和80mg/L组的细胞周期改变,计算增殖指数PI,PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%(G0:静止期;G1:DNA合成前期;S:DNA合成期;G2:DNA合成后期;M:分裂期)。统计学处理时,吸光度值以均数±标准差((?)±S)表示,6个浓度组和4个时间点之间的差异采用SPSS 13.0统计软件包进行6×4析因设计资料的方差分析,各组、各个时间点的组间差异以LSD法行多重比较;G0/G1、S、G2/M期细胞比例及增殖指数均以均数±标准差((?)±S)表示,各组间的差异用SPSS 13.0统计软件包两独立样本t检验(Independent-Samples T Test)。显著性标准均为P=0.05。 4结果 4.1表皮干细胞的分离、培养与免疫细胞化学鉴定 原代分离的人表皮基底层干细胞贴壁生长,呈圆珠状,孵育培养24 h后,贴壁细胞逐渐伸展形成铺路石样。细胞代谢速度缓慢,生长周期漫长。胞体呈圆形、圆梭形,核质比大,胞核将胞浆挤向胞体的周缘。免疫细胞化学染色显示β1整合素、CK19、CK14为阳性,CK10为阴性。 4.2蜕皮甾酮对人表皮干细胞增殖的影响 培养1d、2d时,10、80mg/L浓度组吸光度高于对照组(P0.05),10、20、160mg/L浓度组吸光度与对照组差异无统计学意义(P0.05);培养3d、4d时,各实验组吸光度均高于对照组(P0.05);各时间点所检测的吸光度值均以80mg/L时最高。 4.3蜕皮甾酮对对照组和80mg/L组细胞的周期及增殖指数的影响 对照组G0/Gl期细胞比例高于对照组(P=0.000),而S、G2/M期细胞比例和增殖指数均低于对照组(P=0.000)。 5结论 5.1中成药成分蜕皮甾酮能促进人表皮干细胞的增殖; 5.2该促进作用在蜕皮甾酮浓度为80mg/L时最强; 5.3该促进作用的机制之一可能是其促进人表皮干细胞由G0/G1期进入S期、由S期进入G2/M期; 5.4该促进作用可能是蜕皮甾酮促进创面愈合的机制之一。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R96

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