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《南方医科大学》 2009年
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LMP1~+/mCD99L2~-A20诱导小鼠A20细胞转化为H/RS样细胞的研究

陈小艳  
【摘要】: 研究背景 霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)是一种好发于儿童和中青年的淋巴造血系统恶性肿瘤,它虽然是恶性淋巴瘤的一部分,但其组织病理学特征与非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin's lymphoma,NHL)截然不同,其恶性成分--H/RS(Hodgkin/Reed-Sternberg,H/RS)细胞一般只占肿瘤组织的极少部分(<1%),其余是大量以淋巴细胞为主的背景细胞,如此少量的H/RS细胞是如何生存于大量的背景细胞之中的?它与背景细胞究竟存在什么关系?H/RS细胞是如何发生的?这些问题170多年来一直困扰着医学界。要探究这些悬而未决的问题,当务之急是建立类似人HL病理特征的淋巴瘤动物模型,观察H/RS细胞与背景细胞之间的相互作用,以揭示H/RS细胞生存、增殖、免疫逃避、免疫调节的机制,这是本课题组多年来在国家自然科学基金资助下一直致力研究的核心问题。 最近十几年来有关H/RS细胞的研究取得了很大的进展,研究结果表明H/RS细胞起源于生发中心凋亡前B细胞(残疾B淋巴细胞)。κ基因结合核因子(NF-κB)是调节B细胞分化和存活的重要转录因子,正常状态下NF-κB仅表现为对不同刺激产生一过性活化,但NF-κB在H/RS细胞中则表现为持续活化。NF-κB的持续活化是H/RS细胞显著的分子特征,它能抑制H/RS细胞凋亡,促进其增殖,故NF-κB被认为是H/RS细胞的存活因子。 NF-κB属于一个高度保守的转录因子家族,作为重要的转录调控因子,NF-κB调节很多基因表达,这些基因与细胞增殖、分化、免疫反应、凋亡、转化有着密切关系。现已明确HL的发病机制与EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染有关,其潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)通过模拟激活的CD40受体信号而诱导NF-κB的持续活化。LMP1通过活化NF-κB信号传导通路,下调淋巴细胞CD99的表达,可诱导出具有HL病理学特征的H/RS细胞的产生。研究证实,将LMP1基因转染EBV阴性的BJAB细胞和IM9细胞,使CD99蛋白表达减少或缺失的B淋巴细胞显示出了与H/RS细胞类似的表型。 本研究组前期将LMP1基因导入小鼠B淋巴瘤细胞株A20细胞后,部分细胞出现了H/RS样细胞的形态特征及免疫表型,初步建立了鼠类人H/RS细胞模型;进一步再利用RNAi技术将A20细胞中的mCD99L2(mouse CD99 antigen-like2)基因沉默,经过在体外反复传代、克隆筛选和鉴定,建立了低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株,发现其中也出现了类人HL病理学特征的H/RS样细胞。动物体内成瘤实验结果表明,这种低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株在生物学特性方面与H/RS细胞也具有一定程度的相似性。 然而令人遗憾的是,本研究组前期采用传统的脂质体转染法将LMP1基因转染小鼠B淋巴瘤细胞株A20,由于该细胞属于悬浮细胞,转染效率很低,而且所诱导出的H/RS样细胞因在体外培养困难,故未能成功建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型,动物体内成瘤实验也未能成瘤,因而限制了本课题组对HL发病机制研究的开展。 目前需要亟待解决的问题是,如何建立长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型? 慢病毒载体具有能感染分裂期和非分裂期细胞,使目的基因能在靶细胞内长期稳定表达的优势,而本课题组前期未能成功建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型,本研究拟构建含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体,采用慢病毒转染细胞的技术,将外源基因导入靶细胞A20,在前期课题研究结果的基础之上(LMP1基因导入小鼠B淋巴瘤细胞株A20细胞后,部分细胞出现了H/RS样细胞的形态特征及免疫表型),建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型。 鉴于在EBV阴性的HL细胞株L428表达LMP1后能诱导出更多数量的多核RS细胞的实验研究,以及本课题组前期所建立的低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株也出现了类人HL病理学特征的H/RS样细胞的形态和免疫表型,本研究拟采用所构建的含目的基因LMP1的慢病毒载体再次转染LV-mCD99L2-A20,观察是否能诱导出更多的多核RS细胞,从而建立长期稳定表达LMP1基因同时低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型。另外,本课题组前期将初步构建的表达LMP1基因的小鼠H/RS样细胞皮下接种BALB/c小鼠未能成瘤,再将低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株皮下接种具有健全免疫功能的BALB/c小鼠,因成瘤率极低,仅为3.6%(2/56),显著低于A20细胞在其体内的成瘤率75%(21/28),使我们在构建鼠类人HL病变特征的动物模型方面遇到了另一个挑战。 本研究需要解决的第二个关键问题是:如何提高鼠类人HL病理特征的H/RS样细胞在BALB/c鼠体内的成瘤率? 淋巴瘤为免疫系统恶性肿瘤,其发生与机体免疫状况有着密切的关系,研究表明几乎所有HL伴有AIDS患者的H/RS细胞均有EBV的感染,提示HL的发生既与EBV感染密切相关,同时也伴有免疫功能缺陷。本研究拟将BALB/c小鼠经X线照射后,在降低其免疫功能的基础上,将所构建的表达LMP1的A20细胞以及表达LMP1同时低表达mCD99L2的LV-mCD99L2-A20克隆株皮下接种放射后的BALB/c小鼠,提高鼠类人H/RS细胞在BALB/c小鼠体内的成瘤率,观测鼠类人H/RS细胞在BALB/c小鼠体内的生物学特性、免疫表型和病理特征,从而建立鼠类人HL病理特征的动物模型。 目的 1.构建含目的基因LMP1和报告基因copGFP的重组慢病毒表达载体,进行慢病毒包装和滴度测定。 2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20,探讨悬浮细胞A20最佳的转染方式,为本研究后续工作奠定基础。 3.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,诱导其转化为H/RS样细胞,构建长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型--LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞。 4.构建LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型。 方法 1.含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体的构建与鉴定以及慢病毒包装和滴度测定 根据慢病毒表达载体pCDF1-copGFP的多克隆酶切位点,设计特异性PCR引物,上下游分别引入BglⅡ和EcoRⅠ,以LMP1阳性质粒为模板,扩增目的基因LMP1全长,将之连接到慢病毒表达载体pCDF1-copGFP的多克隆酶切位点,转化大肠杆菌,挑选阳性克隆,经PCR扩增、质粒小量抽提、限制性酶切鉴定和测序鉴定重组载体pCDF1-LMP1-copGFP。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构质粒pFIV、包膜质粒pVSVG和重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入病毒包装细胞293FT,收集病毒上清,再用病毒上清转染293FT细胞,荧光显微镜观察293FT细胞绿色荧光的分布,高倍镜下对发荧光的细胞进行计数,根据SBI公司使用手册提供的公式计算病毒上清液的滴度(Tu/ml): 滴度=(稀释因子)×(绿色荧光细胞数/计数的细胞总数)×(被转染的细胞数)/0.5。 2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20的探讨 分别用传统的脂质体转染技术、新兴发展的Nucleofector~(TM)核酸转染技术和慢病毒载体介导的转染技术,将重组慢病毒表达载体质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入鼠源性B淋巴瘤细胞株A20,荧光显微镜观察A20细胞绿色荧光的分布,高倍镜下对发荧光的细胞进行计数,根据以下公式计算转染效率: 转染效率=(绿色荧光细胞数/计数的细胞总数)×100% 分析比较这三种技术转染悬浮细胞A20的转染效率,探讨A20细胞最佳的转染方式。 3.不同滴度慢病毒转染不同类型细胞转染效率的比较 将大容积包装的慢病毒上清液经低温超速离心浓缩,再分别用慢病毒上清液转染293FT、正常鼻咽上皮细胞和A20细胞,以及用浓缩后的慢病毒(10~7Tu/ml)分别转染293FT、L428和A20细胞,转染5d后,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析不同滴度慢病毒转染不同类型细胞的转染效率。 4.长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型的构建与鉴定 采用经大容量包装和低温超速离心浓缩后的含目的基因LMP1的慢病毒转染A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,有限稀释法筛选LMP1~+A20单克隆和LMP1~+/mCD99L2~-A20单克隆细胞。光学显微镜和透射电镜下观察LMP1~+A20单克隆和LMP1~+/mCD99L2~-A20单克隆细胞的形态特征;光镜下测试网格计数法动态监测大细胞(直径≥25μm)。RT-PCR和Western blot分别检测细胞内LMP1mRNA和LMP1蛋白的表达;MTT法检测细胞体外增殖能力;Transwell检测细胞的微侵袭能力;流式细胞仪检测细胞周期及细胞的免疫表型(CD19与CD30)。PCR检测LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞内shRNA干扰载体的整合情况;RT-PCR及荧光定量PCR检测LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞内mCD99L2表达水平。 5.LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株荷瘤裸鼠和BALB/c小鼠模型构建 分别将LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株皮下接种裸鼠成瘤,观察动物成瘤时间、成瘤率、皮下肿瘤生长速度;取裸鼠瘤块行石蜡包埋、制备病理组织切片、HE染色观察瘤细胞形态;免疫组织化学染色检测瘤组织内LMP1蛋白的表达;取瘤组织做原代培养,RT-PCR检测原代细胞内LMP1mRNA的表达;RT-PCR检测mCD99L2的表达水平;流式细胞仪检测原代瘤细胞CD19和CD30的表达。再分别将LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株皮下接种娇档暮途璛线照射(2Gy)后的同源BALB/c小鼠,做上述检测和鉴定;流式细胞仪检测正常BALB/c小鼠、接种瘤细胞成瘤和未成瘤小鼠外周血中淋巴细胞亚群的比例。 6.统计学处理 采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差(x~-±s)表示。MTT法检测体外细胞增殖能力采用析因设计方差分析比较各组间差异。A20与各组细胞中H/RS样细胞数目的比较采用两因素方差分析(two-wayANOVA)比较组间差异。流式细胞仪检测细胞周期、肿瘤细胞CD抗原表达、外周血淋巴细胞亚群比例数据采用单因素方差分析(One-wayANOVA)比较组间差异,LSD多重比较各组间差异。Transwell法检测细胞体外微侵袭能力和两组之间成瘤时间的比较采用两独立样本t检验进行比较,两组之间成瘤率的比较采用X~2检验。在体肿瘤生长曲线的比较采用重复测量方差分析方法处理,若球形检验P<0.05,拒绝球形检验,用Greenhouse-Geisser进行校正,采用校正后的F值和P值。 结果 1.含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体的构建与鉴定以及慢病毒包装和滴度测定 (1)PCR扩增目的基因LMP1 所设计引物位于LMP1全外显子的上下游,包含起始密码子和终止密码子,扩增片段大小为1.2 kb。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳见一清晰的特异性扩增条带,其大小与理论预期值相符。 (2)LMP1基因重组慢病毒表达载体pCDF1-LMP1-copGFP的构建和鉴定 将构建的LMP1基因重组慢病毒表达载体pCDF1-LMP1-copGFP的菌液经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳可见1.2 kb的目的基因LMP1片段,小量抽提重组质粒,经EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后,获得与目的基因LMP1 1.2kb一致的清晰条带,而空载体质粒上只有6671 bp的单一片段。 (3)DNA测序结果 取重组质粒进行DNA测序,结果表明我们所获得的LMP1片段与GenBank所公布的相应序列一致,无碱基缺失及错误。 (4)慢病毒包装及滴度测定结果 用脂质体将已构建的慢病毒载体系统中3种质粒成分导入病毒包装细胞293FT中,荧光显微镜下见大量绿色荧光,证实已有大量质粒转入293FT细胞,绿色荧光位于细胞的胞膜及胞浆,这与LMP1的表达位置一致。取病毒上清液转染293FT细胞,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布,测定病毒上清液的滴度为1.6×10~5Tu/ml。 2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20 (1)脂质体转染 通过阳离子脂质体Lipofectamine~(TM) 2000介导,将重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入A20细胞,转染24~48h后,荧光显微镜下观察仅见个别细胞有绿色荧光。 (2)Nucleofector~(TM)核酸转染 采用Amaxa核酸转染仪,将特定的转染溶液Nucleofector~(TM)和重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入A20细胞,转染4~48h后,荧光显微镜下观察可见较多细胞有绿色荧光,转染效率在10%左右,表明Nucleofector~(TM)核酸转染技术可明显提高A20细胞的转染效率。但是,转染72h后几乎不见绿色荧光细胞,并且细胞死亡率逐渐提高。 (3)慢病毒上清液转染 用含目的基因LMP1的慢病毒上清液转染293FT、正常鼻咽上皮和A20细胞,转染5d后,荧光显微镜下观察,293FT和鼻咽上皮细胞可见较多的绿色荧光,转染效率约为80%,而A20细胞则有少许细胞有绿色荧光,转染效率<1%。 3.浓缩后的慢病毒转染不同类型细胞转染效率的比较 用经过大容积包装和低温超速离心浓缩后的慢病毒(滴度为10~7Tu/ml)分别转染293FT、L428和A20细胞,其转染效率分别为100%、90%和80%。 4.长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型的构建与鉴定 (1)采用经低温超速离心浓缩后的含目的基因LMP1的慢病毒分别转染A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,有限稀释法筛选出LMP1~+A20细胞单克隆株和LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞单克隆株。转染25d后,倒置显微镜和普通光学显微镜观察,发现细胞出现明显的形态改变,细胞体积增大,直径≥25μm,胞浆丰富,细胞核及核仁明显增大,出现单核、双核和多核H/RS样细胞。 (2)透射电镜观察,转型后的LMP1~+A20细胞体积增大,胞浆丰富,细胞器增多,主要表现为线粒体和内质网增多。最明显的是细胞核增大,核仁明显增大,出现多核和双核细胞。 (3)细胞计数结果经两因素方差分析显示,不同细胞组之间差异具有显著性(F=529.733,P=0.000),三组细胞经LSD多重比较显示,LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞中H/RS样细胞与对照组A20细胞相比,差异具有显著性(P=0.000),LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞中H/RS样细胞数目较A20细胞中的H/RS样细胞多;而LMP1~+A20与LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞中H/RS样细胞数无统计学差异。 (4)RT-PCR检测LMP1~+A20细胞和LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞内LMP1mRNA表达阳性,而对照组A20细胞表达阴性。 (5)Western blot检测LMP1~+A20细胞内LMP1蛋白表达阳性,而空载体组pCDF-A20细胞和对照组A20细胞表达阴性。 (6)MTT检测发现LMP1~+A20细胞体外增殖能力较空载体组pCDF-A20细胞和对照组A20细胞减慢,差异有显著性(P<0.05)。 (7)Transwell法检测细胞体外微侵袭能力,发现LMP1~+A20细胞的运动能力比pCDF-A20细胞明显减慢,差异具有显著性(P=0.000)。 (8)流式细胞仪检测细胞周期发现LMP1~+A20、pCDF-A20与A20细胞G1期和S期比例无显著性差异,LSD多重比较结果显示:LMP1~+A20细胞G_2期比例高于pCDF-A20组和A20组,差异有显著性(P=0.010)。pCDF-A20组与A20组G_2期差异不显著(P=0.966)。 (9)流式细胞仪检测细胞的免疫表型,单因素方差分析显示LMP1~+A20、pCDF-A20与A20三组细胞CD30阳性细胞比例有显著性差异(F=326.125,P=0.000),CD19阳性细胞比例无显著性差异(F=4.473,P=0.650)。LSD多重比较结果显示LMP1~+A20细胞CD30阳性细胞比例(72.600±1.990%)高于对照组A20细胞(41.173±1.620%)和pCDF-A20细胞(41.587±1.543%),差异有显著性(P=0.000,P=0.000)。 (10)抽提LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞DNA进行PCR,能检测出ShRNA干扰载体稳定整合至细胞基因组。 (11)RT-PCR及荧光定量PCR检测LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞mCD99L2的表达水平低于A20细胞,mCD99L2基因的干扰效率约为50%。 5.LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株荷瘤裸鼠模型的构建与鉴定 (1)成瘤情况:LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株2×10~7细胞分别皮下接种裸鼠3只(6个位点),成瘤率100%,成瘤时间分别为9.5±2.9d和10.5±1.4d。 (2)病理形态观察:光镜下见瘤细胞弥漫分布,大小不一,细胞核大深染,核圆形、卵圆形或不规则形,病理性核分裂像多见;LMP1~+A20克隆株和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株均可见散在分布的胞浆丰富的大细胞,呈双核、多核或不规则核,核仁大,微嗜酸性。这些大细胞极其类似人HL的H/RS细胞形态。 (3)免疫组织化学染色:瘤组织内LMP1蛋白表达阳性,阳性定位于细胞膜。 (4)取瘤组织做原代培养,RT-PCR检测原代瘤细胞内LMP1mRNA的表达,琼脂糖凝胶电泳可见1.2kb片段; (5)RT-PCR检测LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞内mCD99L2的表达水平,低于对照组A20细胞。 (6)流式细胞仪检测LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20原代瘤细胞CD19和CD30的比例分别为83.6%、52.5%和87.1%、61.2%。 6.LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株BALB/c小鼠模型的建立 (1)成瘤情况:LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株2×10~7细胞分别皮下接种BALB/c小鼠,两株细胞未照射组(n=4)均未成瘤;照射后24h组(n=4)接种LMP1~+A20细胞成瘤率为100%,接种LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞成瘤率为75%。结果表明将两组瘤细胞接种未经照射的BALB/c小鼠,均未见肿瘤形成,而X线全身照射(2Gy)BALB/c小鼠后24h接种瘤细胞则能显著提高成瘤率。 (2)病理形态观察:光镜下见瘤细胞弥漫分布,大小不一,细胞核大深染,核圆形、卵圆形或不规则形,可见散在的胞浆丰富的大细胞,呈双核、多核或不规则核,核仁大,微嗜酸性,其中可见“镜影细胞”,在肿瘤细胞周围可见淋巴细胞呈散在或灶性浸润,另还可见浆细胞和组织细胞等背景细胞。 (3)免疫组织化学染色:检测瘤组织内瘤细胞LMP1表达阳性,定位于细胞膜和细胞浆。 (4)RT-PCR检测原代瘤细胞内LMP1 mRNA的表达,可见1.2kb片段; (5)RT-PCR检测LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞内mCD99L2的表达水平,低于对照组A20细胞。 (6)外周血淋巴细胞亚群:对接种LMP1~+A20细胞和LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞成瘤和未成瘤的BALB/c小鼠外周血进行流式细胞检测CD3、CD4、CD8、CD19阳性淋巴细胞亚群的比例,并与正常BALB/c小鼠(n=4)进行比较。方差分析显示五组间各指标均存在显著性差异。LSD多重比较显示:接种LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞成瘤鼠和未成瘤鼠间CD3(P=0.000)、CD4(P=0.000)、CD8(P=0.000)、CDl9(P=0.000)阳性细胞比例有显著性差异;成瘤鼠CD3、CD4、CD8低于未成瘤鼠,CD19高于未成瘤鼠,而接种LMP1~+A20细胞成瘤鼠和接种LMP1~+/mCD99L2~-A20细胞成瘤鼠间CD3、CD4、CD8、CD19阳性细胞比例无显著性差异。 结论 1.高滴度慢病毒表达载体可高效转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,较脂质体转染法和Nucleofector~(TM)核酸转染法有明显的优势。 2.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,能诱导A20细胞转化为H/RS样细胞,建立了长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的小鼠H/RS样细胞模型。 3.将LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株分别皮下接种裸鼠和经X线照射后的BALB/c小鼠,建立了LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型,后者出现了淋巴细胞、浆细胞和组织细胞等背景细胞,类似人cHL的病理特征。 创新之处 1.探索出了一种高效转染悬浮细胞A20的方法--高滴度慢病毒转染法。 2.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,建立了长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的小鼠H/RS样细胞模型。 3.将LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株分别皮下接种裸鼠和经放射后的BALB/c小鼠,建立了LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型,后者出现了类似人cHL的病理特征,初步建立了类人HL小鼠模型。 4.X线照射BALB/c小鼠(2Gy)降低其免疫功能后,便于建立荷瘤动物模型。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R733.1

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李先茂,朱梅刚,沈丽佳,刘腾飞,张三泉,张进华,张彦,赵彤;小鼠A20RS样细胞模型的初步建立[J];第四军医大学学报;2005年04期
2 李振宇;慢病毒载体构建及结构优化[J];国外医学(分子生物学分册);2002年05期
3 钱锋,肖成组;电击缓冲液对哺乳动物细胞电穿孔效率的影响[J];军事医学科学院院刊;1999年02期
4 刘芳;张弓;陈小艳;李慧灵;张彦;王怡心;黄作平;褚红娟;王辛;赵彤;;播散性鼠B细胞淋巴瘤动物模型的建立[J];临床与实验病理学杂志;2008年03期
5 余英豪;霍奇金淋巴瘤研究进展[J];实用肿瘤杂志;2005年01期
6 张宁;脱帅;刘秋珍;杨波;王明耀;朱希伟;;人肝恶性淋巴瘤裸小鼠原位和皮下移植模型的建立及生物学特性的研究[J];消化外科;2006年01期
7 刘芳;沈丽佳;陈小艳;李慧灵;黄作平;张弓;褚红娟;赵彤;;低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系的建立及鉴定[J];中国病理生理杂志;2008年08期
8 蔡磊;李艳;窦科峰;张巍;丁睿;赵青川;;电穿孔转染悬浮细胞条件的优化[J];中国医科大学学报;2008年04期
9 邵晓枫,杨纯正,熊冬生,许元富,彭晖,赖增祖,朱祯平;人B淋巴瘤裸鼠腹腔内移植模型[J];中国肿瘤临床;2001年03期
10 周新华,赵彤,余江,沈新明,朱梅刚;蛋白和基因水平探索H/RS细胞的起源[J];中华血液学杂志;2003年10期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 周军智;邹永康;李建国;刘楠乔;蔡亚非;王根林;;含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定[J];安徽师范大学学报(自然科学版);2009年02期
2 花怀珍;;宫颈液基细胞学联合阴道镜检查在宫颈病变诊断中的价值[J];安徽卫生职业技术学院学报;2009年01期
3 汤永祥;张金平;;青年妇女卵巢卵泡膜细胞瘤MRI诊断分析[J];安徽医药;2012年07期
4 曲真真;石建华;汪万英;;nm23和Bcl-2基因在甲状腺肿瘤中的研究进展[J];蚌埠医学院学报;2009年03期
5 曲真真;石建华;汪万英;;甲状腺乳头状癌nm23和bcl-2表达的临床意义[J];蚌埠医学院学报;2009年11期
6 王辉;吴洁;花宝金;孙桂芝;;人胃癌免疫缺陷小鼠移植瘤转移模型研究进展[J];北京中医药;2012年03期
7 王宝华;王海燕;王娟;左晓文;林春梅;刘勇;杨爽;;应用超声背向散射积分评价高脂血症患者颈动脉粥样硬化[J];吉林大学学报(医学版);2006年05期
8 冯国红;胡亚玲;姜伟丽;何万彬;张亚平;;鼻腔鼻窦曲菌病18例临床病理分析[J];包头医学;2012年01期
9 郑建民;;高频彩超诊断小儿肠系膜淋巴结炎50例临床分析[J];滨州医学院学报;2009年04期
10 刘真喜;余力;欧阳小明;;fascin蛋白在经典型霍奇金淋巴瘤R-S细胞中的表达及其意义[J];重庆医学;2008年16期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 薛成骞;曹宁;陈华英;李木森;;C/C+HA涂层复合材料对山羊骨缺损修复的组织学和生物相容性研究[A];第十二届中国体视学与图像分析学术会议论文集[C];2008年
2 郝一;宋伦;张煦;单文姣;李亚林;王德望;;病理学课程的探究式教学模式探讨[A];中国临床解剖学杂志2013年7月第31卷第4期[C];2013年
3 吴建群;;巨大心脏粘液瘤猝死1例[A];全国第九次法医学术交流会论文集[C];2013年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵武干;Hsa-mir-217在胰腺导管腺癌中的表达及功能的初步验证[D];北京协和医学院;2010年
2 刘小倩;吲哚胺2,3-双加氧酶在非霍奇金淋巴瘤免疫耐受中的作用及机制探讨[D];山东大学;2010年
3 王楠娅;腺相关病毒载体介导的MDA7/IL-24基因治疗小鼠B细胞淋巴瘤的疗效与机制研究[D];吉林大学;2011年
4 崔赵丽;气虚、阳虚体质与慢性原发性肾小球疾病中医证候及TGF-β相关性分析[D];北京中医药大学;2011年
5 颜汝平;负载肿瘤抗原的DC疫苗体内外诱导的特异性抗膀胱癌效应研究[D];昆明医学院;2011年
6 黑任轶;microRNA在耳蜗前体细胞增殖和分化中的作用探讨[D];第四军医大学;2011年
7 刘繁荣;RANTES/CCL5表达与mCD99L2~-A20细胞构建糖尿病鼠类HL模型的初步研究[D];南方医科大学;2011年
8 刘阁玲;甲状腺癌发生、发展过程中相关基因的表达及克隆[D];河北医科大学;2005年
9 侯萍;纽卡斯尔病毒疫苗、白细胞介素-12、15对人卵巢癌免疫治疗作用的实验研究[D];山东大学;2004年
10 于永生;人尿激酶原突变体的构建与特性分析[D];西北农林科技大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 胡爱侠;乳腺癌组织中mTOR、eIF4E、4EBPS蛋白的表达及意义[D];郑州大学;2010年
2 李贝;血脂安Ⅱ号对实验性高脂血症大鼠血脂、Ox-LDL及MDA-LDL的影响[D];湖南中医药大学;2010年
3 徐翠;抑癌基因Maspin与Caspase-3、MVD在上皮性卵巢癌中的表达及相关性研究[D];泰山医学院;2010年
4 蔡吓妹;基于OCT和TPEF技术的大鼠早期急性心肌缺血的实验研究[D];福建师范大学;2010年
5 张启富;脑卒中胸大肌痉挛的无水酒精和肉毒毒素A局部注射的对比观察[D];广西医科大学;2011年
6 谢澎;CD3~+CD56~+NKT细胞及其亚群在甲状腺癌患者的表达及临床意义[D];山西医科大学;2011年
7 王旭峰;RECK和MMP-9在喉鳞癌中的表达及相关性研究[D];山西医科大学;2011年
8 贾琳;肺腺鳞癌临床病理特征及预后分析[D];吉林大学;2011年
9 王英;经典型霍奇金淋巴瘤相关免疫标记物表达的研究[D];吉林大学;2011年
10 高金莹;改良后支气管镜下肺灌洗术对肺癌诊断价值的研究[D];吉林大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张永清,黄高升,王哲,闫庆国,郭英;BCL-6表达对生发中心形成及淋巴瘤发生的作用[J];第四军医大学学报;2002年08期
2 李先茂,李燕,赵彤,朱梅刚,张进华;霍奇金淋巴瘤CD99基因表达缺失的意义[J];第四军医大学学报;2004年23期
3 蔡磊;霍斌亮;张巍;张福琴;赵青川;;siRNA干扰ADAR1表达对小鼠混合淋巴细胞培养的影响[J];第四军医大学学报;2007年05期
4 沈丽佳;方唯意;谢思明;何滢;蒋会勇;赵彤;;小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建[J];南方医科大学学报;2006年02期
5 张素娟,余英豪;介绍一种新的免疫组化染色方法S-P法[J];第一军医大学学报;1994年01期
6 孙琦;陈辉树;;恶性淋巴瘤的病因学研究进展[J];国际输血及血液学杂志;2006年05期
7 何滢;沈丽佳;李祖国;谢卫兵;谢思明;刘芳;刘腾飞;蒋会勇;赵彤;;mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞的影响[J];基础医学与临床;2007年06期
8 张素娟,赵彤,董敬朋,赵菲,邱红明,朱梅刚;石蜡切片DNA提取方法的改良及其临床应用[J];临床与实验病理学杂志;1996年04期
9 赵青川,张德新,罗晓星,苏映军,扬静华;RNA编辑酶ADAR1对淋巴细胞系增殖的影响[J];免疫学杂志;2002年04期
10 沈慧玲,陈子兴,王玮,段卫明,傅建新;电穿孔法基因转染悬浮细胞条件的优化[J];苏州大学学报(医学版);2004年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈璋;朱立平;;淋巴细胞的分化、成熟、活性化与细胞内代谢[J];国际免疫学杂志;1979年03期
2 施渭康,除振国,姚(金王玉);小鼠F9畸胎癌细胞对维生素A酸诱导反应的差异性[J];实验生物学报;1982年01期
3 村松乔;顾永清;;细胞分化与糖蛋白[J];医学分子生物学杂志;1983年02期
4 石善溶;;角质的免疫组织化学定位对上皮细胞分化的研究[J];四川医学;1986年05期
5 朱立平;许贤豪;张淑珍;陈丹;张振馨;谭铭勋;刘士廉;;PWM诱导sIg-B淋巴细胞分化[J];中国免疫学杂志;1986年03期
6 许淑华;多发性骨髓瘤恶性事件发生在前体淋巴细胞内的细胞遗传学证据[J];国际遗传学杂志;1987年01期
7 朱立平;房芳;;人B淋巴细胞分化的表面标志[J];细胞生物学杂志;1987年04期
8 乔崇年;;淋巴细胞白血病细胞的表面标记分析及其与细胞分化的关系[J];浙江大学学报(医学版);1989年02期
9 汪济广,司徒镇强,吴军正,陈建元;二甲基亚砜诱导MEC-1系细胞分化的研究[J];实用口腔医学杂志;1990年04期
10 李刚毅;赵宝昌;;DMSO致小鼠肝癌腹水瘤细胞Hca-F25/CL-A_2分化后钙恒稳的变化[J];大连医科大学学报;1991年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 方艳芬;林美花;周星露;朱琼文;杨波;何俏军;;泛素-蛋白酶体系统参与的周期调节在全反式维甲酸(ATRA)诱导的白血病细胞分化过程中的作用研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
2 何国雄;李飞;李海标;梁志忠;潘志信;利玉欢;黄锦桃;;移植成人骨髓间质干细胞在脑梗死模型鼠的分化及功能恢复研究[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年
3 高毅;慕宁;唐力军;;体外诱导人骨髓多能成体祖细胞向肝样细胞分化的实验研究[A];肝脏病防治学术研讨会及新进展学习班专刊[C];2005年
4 李春蕊;刘文励;孙汉英;周剑锋;孟凡凯;;ERK信号传导途径在丁酸钠诱导SKM-1细胞分化中的作用研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年
5 余细勇;李晓红;;骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的分子调节机制研究[A];第九届全国心血管药理学术会议论文集[C];2007年
6 李东;欧阳建;李翠萍;陈军浩;;消癌平注射液对白血病细胞NB4作用的初步研究[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
7 贺新强;崔克明;;植物次生木质部细胞分化过程中的细胞编程死亡和次生壁构建[A];中国植物学会植物结构与生殖生物学专业委员会、江苏省植物学会2007年学术年会学术报告及研究论文集[C];2007年
8 毕黎琦;刘波;马翠丽;郭嘉隆;;BXSB狼疮鼠胸腺及T细胞分化异常在发病中的作用及其免疫调节研究[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年
9 李立;田俊;刘志国;杨璞;宗义强;屈伸;;全反式维甲酸诱导胃腺癌细胞分化过程中VLDLR亚型表达的变化[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年
10 顾问;郭雪君;丁涛;;SiRNA干扰Notch信号通路胞外分子Fringe对哮喘时T细胞分化的影响[A];中华医学会呼吸病学年会——2011(第十二次全国呼吸病学学术会议)论文汇编[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 施嘉奇 通讯员 王姿英;探索中药对干细胞分化的作用[N];文汇报;2009年
2 王姿英;中英合作中药调控干细胞分化研究启动[N];中国医药报;2009年
3 陈超;科学家发现引发细胞分化的分子通道[N];科技日报;2010年
4 记者 毛黎 冯卫东;美开发出使干细胞分化成肌肉的基因开关[N];科技日报;2009年
5 张佳星;分化之路 殊途同归[N];科技日报;2008年
6 岳阳;我国学者初建HIF-1α介导白血病细胞分化新理论[N];中国医药报;2006年
7 张佳星;干细胞分化路径存在差异性[N];中国矿业报;2008年
8 刘霞;诱导多功能干细胞“不忘”原初组织[N];科技日报;2010年
9 本报记者 刘垠;中国干细胞研究应向大动物实验平台挺进[N];大众科技报;2009年
10 钱铮;日本新发现,可能修改传统血细胞分化路径图[N];新华每日电讯;2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴江群;骨髓基质干细胞体内成骨分化研究[D];中国协和医科大学;2008年
2 晏丽;甲基转移酶抑制剂AdOx对细胞多能性相关基因调控的研究[D];北京协和医学院;2011年
3 吴鑫;重离子辐照后细胞中BTG1蛋白变化及相关调控通路的研究[D];中国科学院研究生院(近代物理研究所);2014年
4 辛晓玲;特定转录因子诱导新生牛成纤维细胞为多能性干细胞的研究[D];西北农林科技大学;2011年
5 刘波;胸腺及T细胞分化异常在系统性红斑狼疮发病中的作用及免疫调节研究[D];吉林大学;2005年
6 姚乃晖;釉原蛋白对MDPC-23细胞分化影响的实验研究[D];第三军医大学;2011年
7 彭荣;高分子表面微图案技术研究干细胞形状、尺寸和密度对其分化的影响[D];复旦大学;2012年
8 高娇;小鼠胚胎造血前体细胞的表面标志研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
9 刘展;Th17和Treg细胞对帕金森病模型小鼠的神经炎症和多巴胺能神经元损伤的作用及其机制研究[D];苏州大学;2014年
10 翟波;c-Crk和C3G在3T3-L1脂肪细胞分化过程中的作用[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 阴津华;小檗碱对人大网膜前脂肪细胞增殖与分化的影响[D];山西医科大学;2005年
2 任于果;大鼠胚脑皮层源性神经干细胞体外培养及增殖分化特点[D];安徽医科大学;2005年
3 汪蕾;“心肌样”环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究[D];武汉大学;2005年
4 崔盈;神经干细胞移植治疗缺氧缺血性脑病新生鼠的实验研究[D];苏州大学;2010年
5 杨文飞;共培养法诱导骨髓间充质干细胞向毛细胞样细胞分化的实验研究[D];福建医科大学;2011年
6 魏欣;胎儿骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化[D];第四军医大学;2005年
7 刘楠;Wnt信号通路状态与白藜芦醇抗髓母细胞瘤细胞作用关系的研究[D];大连医科大学;2007年
8 郝晓娜;复方木鸡冲剂对肿瘤细胞诱导凋亡和分化作用的分析[D];大连医科大学;2007年
9 李玲巧;细胞培养芯片的研制及芯片内骨髓间充质干细胞分化控制的前期研究[D];厦门大学;2009年
10 于娜;rhBMP-2和Delta-1对人牙髓干细胞分化影响的实验研究[D];第三军医大学;2009年
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