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《南方医科大学》 2010年
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人全血细胞因子在免疫抑制状态评估中的应用

何懿  
【摘要】: 背景 器官移植术后病人和自身免疫性疾病患者都常规使用免疫抑制剂治疗,同时相当一部分肿瘤患者需要接受放疗或者化疗。这些治疗方案对患者的免疫系统有很强的抑制作用,这就不可避免的带来了一个重要问题:如何合理使用免疫抑制剂、制定放疗或化疗方案?一方面如果免疫抑制剂使用不足可能导致移植器官的排斥,或者自身免疫性疾病加重;另一方面如果免疫抑制剂使用过度或者放疗、化疗过量,使患者免疫系统功能被过度抑制,则可能引发严重的感染。目前,器官移植术后和自身免疫疾病死亡病人中,有相当一部分是由于免疫抑制剂使用过度继发严重感染造成。因此如何合理使用免疫抑制剂,制订合适的放疗、化疗方案是目前临床急需解决的一大难题。而造成这一难题的主要原因是目前没有一种快速有效的办法能够评估患者的免疫状态,因而无法准确的判断免疫抑制剂或者放疗化疗方案使用是否合理。 细胞因子由机体免疫细胞分泌,是机体免疫系统功能的执行者和体现者,细胞因子的水平很大程度上反映了机体免疫系统的状态。因此我们可以通过评估机体的细胞因子水平来反映机体的免疫状态,从而指导临床医生合理用药。 在细胞因子检测方面,我们选取先进的液态悬浮芯片技术作为细胞因子的检测方法。此方法可同时检测一份样本中多达100种细胞因子的含量。 目的 1.找到适合的免疫刺激剂,能够快速有效地刺激全血免疫细胞分泌细胞因子。 2.通过体外实验,研究不同免疫抑制剂对细胞因子的抑制作用,总结出不同免疫抑制剂特异性的细胞因子谱。 3.进一步收集临床肾移植病人血样本,总结出不同免疫状态(移植物存活良好,移植物排斥,感染等)下病人细胞因子的变化规律,建立不同免疫状态下的细胞因子谱,用于评估患者免疫状态。 方法 1.实验样本的选择 以往实验多选用稀释的全血或者分离的单个核细胞作为研究对象,我们进行体外实验的目的是为了更好的模拟机体的内环境,因此我们选择未稀释的肝素化全血作为我们的研究样本,更好的模拟全血细胞所处的内环境。 2.免疫刺激剂的选择 我们比较不同免疫刺激剂刺激全血细胞分泌细胞因子的能力。对比PHA和PMA+IONO刺激全血细胞分泌细胞因子的变化。进一步找出PMA+IONO刺激全血细胞分泌细胞因子的最佳浓度和最佳刺激时间。 3.不同免疫抑制剂以及同一免疫抑制剂不同浓度条件下细胞因子的变化 加入不同免疫抑制剂与全血共同培养6小时,保证免疫抑制剂与全血细胞充分作用,再加入免疫刺激剂PMA+IONO刺激全血细胞分泌细胞因子,研究不同免疫抑制剂对不同细胞因子的抑制作用,以及同一免疫抑制剂不同浓度条件下抑制作用的变化。 4.免疫抑制剂单用及联合运用对细胞因子谱的影响 按照临床常见的免疫抑制剂组合,MPA+DEX+FK或者MPA+DEX+CsA联合使.用,比较免疫抑制剂单用和联合使用条件下,细胞因子谱的变化规律。 5.细胞因子检测方法的选择 在细胞因子检测方面,我们需要全面快速分析全血中多种细胞因子,因此传统的ELISA技术、蛋白质组学技术均无法满足我们的需求。而液态悬浮蛋白芯片技术:它将流式检测与芯片技术有机地结合在一起,最多可以检测一份样本中100种细胞因子的水平,而且检测时间短,一次检测大概花费2小时。因此我们选用通过了美国FDA认证的液态悬浮蛋白芯片技术作为细胞因子的检测技术。 6.统计学方法 采用SPSS13.0对数据进行统计分析。采用方差分析进行多组之间的比较,采用LSD法(方差齐)或者Dunnett'sT(方差不齐)进行多组之间的两两比较。 结果 1. PMA+IONO能够快速有效的刺激细胞因子的分泌,PMA(0.15μg/ml)+IONO(2.5μg/ml)为刺激细胞因子分泌的最佳刺激浓度。6小时为PMA+IONO刺激细胞因子分泌的最佳时间点。 2.低浓度DEX (0. 1μg/ml)、中浓度DEX (1μg/ml)及高浓度DEX (10μg/ml)均能抑制的细胞因子:IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-γ, TNF-a, IL-13和GM-CSF。此外,中浓度DEX (1μg/ml)及高浓度DEX (10μg/ml)还能抑制的细胞因子有:G-CSF。 3.低浓度CsA(0.05μg/ml)、中浓度CsA(0.25μg/ml)及高浓度CsA(1.25μg/ml)能抑制的细胞因子:IL-17, IFN-γ, G-CSF和GM-CSF。中浓度CsA(0.25μg/ml)及高浓度CsA (1.25μg/ml)能抑制的细胞因子:IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13和TNF-α。 4.低浓度FK (1ng/ml)不能抑制任何细胞因子,中浓度FK (5ng/ml)能抑制细胞因子GM-CSF。高浓度FK (20ng/ml)能抑制的细胞因子有:IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, IFN-γ, TNF-a和G-CSF。 5.各个浓度的MPA均无法抑制任何细胞因子的分泌。 6.在DEX(1μg/ml), FK(5ng/ml)和MPA(10μg/ml)三联方案中: 1) IL-2, GM-CSF:同空白组相比,仅三药联用组能够抑制IL-2的分泌。 2) IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, G-CSF:同空白组相比,DEX组及三联用药均能抑制这几种细胞因子的分泌.三联用药组与FK组,MPA组细胞因子水平也有统计学差异。 3) IFN-y:同空白组相比,MPA组、DEX组及三联用药均能抑制IFN-γ的分泌。三联用药组与FK组,MPA组细胞因子水平也有统计学差异。 4) IL-10, IL-17:同空白组相比,单用或联用药物组均无法抑制其分泌。 7.在DEX(1μg/ml), CsA(0.25μg/ml)和MPA(10μg/ml)三联方案中: 1) IL-4, GM-CSF:三联用药组与空白组、MPA组有统计学差异,因此IL-4, GM-CSF主要反映的是CsA和DEX的协同作用。 2) IL-5, IL-6, IL-13:三联用药组与空白组、CsA组及MPA组有统计学差异,因此IL-5, IL-6, IL-13主要反映的是DEX的作用。 3) IL-10, G-SCF:三联用药组与空白组、DEX组及MPA组有统计学差异,因此IL-10, G-SCF主要反映的是CsA作用。 4) IL-2, IFN-y, TNF-a:三联用药组与CsA、DEX、MPA三药单用组均有统计学差异,因此这3个因子反映的是三个免疫抑制剂总体协同抑制作用。 5) IL-17:各组之间均无统计学差异。 结论: 1. PMA+IONO能够更快速有效的刺激全血细胞分泌细胞因子。 2.除MPA外,其他免疫抑制剂均能有效的抑制在PMA+IONO刺激条件下某些全血细胞因子的分泌,不同免疫抑制剂有其特异的细胞因子抑制谱。随着免疫抑制剂浓度的增高,细胞因子的抑制程度也增高。 3.免疫抑制剂在单用和联用条件下,细胞因子谱有一定变化。在FK, DEX及MPA三联方案中,我们总结发现:IL-2主要反映三种药物的协同抑制作用;IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IFN-γ, TNF-a, G-CSF主要反映DEX的抑制作用;GM-CSF主要反映DEX及FK的协同抑制作用。在CsA, DEX及MPA三联方案中,IL-2, IFN-y, TNF-a主要反映三药联用的抑制情况;IL-4, GM-CSF主要反映CsA和DEX的联合抑制作用;IL-5,IL-6,IL-13主要反映DEX的抑制作用。IL-10, G-CSF主要反映的是CsA的抑制作用。从我们总结的结果可以得知,即使在三种免疫抑制剂联合使用的情况下,仍然有某些细胞因子特异的反映某一类免疫抑制剂的作用,因此我们可以通过检测这类细胞因子,反映其相对应的免疫抑制剂的用量,从而更好的指导临床医生更准确的调整免疫抑制剂,合理用药。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R392

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