血管紧张素Ⅱ经氧化应激途径损伤胰岛β细胞功能的实验研究及机制探讨

【摘要】： 研究背景： 胰岛β细胞功能受损和外周组织胰岛素抵抗是2型糖尿病发病机制的两个主要因素。日益增多的事实表明,胰岛β细胞异常可能是2型糖尿病发生发展的中心环节。英国前瞻性糖尿病研究(the United Kingdom prospective diabetes study,UKPDS)显示,新诊断的2型糖尿病患者胰岛β细胞功能只有正常人的50%,其后β细胞功能以每年4%～5%的速度下降。因此,探讨胰岛β细胞功能损伤的机制及保护策略一直是糖尿病领域研究的热点和难点。 近年来,LIFE(氯沙坦干预降低高血压患者终点事件研究)、CAPPP(卡托普利防治计划)、SCOPE(老年人认知和预后研究)等多个大型临床循证研究证实使用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)或血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker,ARB)在降低血压的同时,能显著减少高危人群新发2型糖尿病的危险。DREAM(雷米普利和罗格列酮减少糖尿病的评估)研究表明ACEI类药物雷米普利可使空腹血糖受损(impaired fasting glucose,IFG)或糖耐量异常(imparied glucose tolerance,IGT)的患者血糖恢复正常,并且显著降低糖负荷后血糖水平。最新的NAVIGATOR(那格列奈和缬沙坦治疗糖耐量受损人群的预后研究)研究证实对于合并心血管风险的IGT患者,在严格生活方式干预基础上,采用缬沙坦能有效预防新发糖尿病达14%。上述这些临床研究初步提示2型糖尿病与肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)之间有着密切的联系,但具体机制如何目前尚不清楚。因此,探讨两者之间的内在关系成为近几年糖尿病领域的研究热点。 随着人们对2型糖尿病与RAS之间关系的日益关注,大量研究证实阻断RAS减少糖尿病的发生,一方面归因于RAS阻断剂对外周胰岛素敏感性和糖代谢的改善；另一方面归因于RAS阻断剂对胰岛β细胞起着重要的保护作用。业已证实氧化应激是β细胞功能损伤的重要机制之一,β细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生可通过影响胰岛素基因表达,损伤胰岛素分泌功能及促凋亡、抑制增殖等多条途径损伤p细胞功能。此外,大量研究提示胰岛局部RAS激活与β细胞氧化应激发生之间存在密切联系。但是,局部RAS最重要的活性组分——血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)经氧化应激途径损伤β细胞功能的研究目前缺乏足够的实验证据,其具体分子机制仍有待阐明。 因此,本课题以β细胞株RIN-m细胞为研究对象,拟从如下三个方面进行深入探讨：(1)观察AngⅡ及氯沙坦预处理对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响,检测各组细胞内ROS水平,同时检测各组细胞胰岛素转录因子胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox factor 1,PDX-1)及肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A (Mus muscular v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family proteinA,MafA)表达,探讨AngⅡ是否通过氧化应激途径影响胰岛素关键转录因子PDX-1及MafA活性,进而影响β细胞胰岛素基因表达；(2)观察AngⅡ及氯沙坦预处理对RIN-m细胞胰岛素分泌功能的影响,检测各组细胞解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)表达、线粒体膜电位、细胞内三磷酸腺苷二钠(adenosine triphosphate,ATP)含量及Ca2+浓度,探讨AngⅡ是否通过氧化应激-UCP2途径影响β细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)功能；(3)观察AngⅡ及氯沙坦预处理对RIN-m细胞增殖活性的影响,透射电镜观察细胞超微结构的改变,检测细胞凋亡率,B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-2相关x蛋白(Bcl-2-associated x protein,Bax)表达及Caspase9、3的活性,探讨AngⅡ是否经氧化应激影响凋亡相关信号分子的表达,最终通过线粒体途径诱导p细胞凋亡 第一部分：AngⅡ对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响及相关机制 目的： 探讨AngⅡ对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响及其相关分子机制。 方法： (1)RIN-m细胞的培养及活性测定：含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基,于37℃,5%C02培养箱中培养RIN-m细胞,0.4%台盼蓝染色检测细胞活性。 (2)AngⅡ对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响：细胞分为A～E五组,A组为空白对照组,添加RPMI-1640完全培养基；B～E组为不同浓度AngⅡ处理组,添加终浓度分别为0.1、1、10、10nMAngⅡ的培养液。各组处理完毕后,37℃,5%CO2培养箱中分别孵育12h、24h或36h,RT-PCR检测各组细胞胰岛素基因表达。 (3)氯沙坦预处理对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响：细胞分为A-C三组,A组为空白对照组,添加RPMI-1640完全培养基；B组为100nMAngⅡ组,添加终浓度为100nMAngⅡ的培养液；C组为氯沙坦预处理组,向培养基中添加1μM氯沙坦后15min添加100nMAngⅡ。各组处理完毕后,置于37℃,5%CO2培养箱中孵育24h,RT-PCR检测各组细胞胰岛素基因表达。 (4)氯沙坦预处理对RIN-m细胞内ROS水平的影响：细胞分组同(3)部分。干预24h,100μM DCFH-DA荧光探针负载后流式细胞仪检测DCF平均荧光强度,反映细胞内ROS水平。 (5)氯沙坦预处理对RIN-m细胞PDX-1及MafA表达的影响：细胞分组同(3)部分。干预24h, RT-PCR检测细胞PDX-1及MafA mRNA表达,Western-blot检测细胞PDX-1及MafA蛋白表达。 结果： (1)RIN-m细胞形态观察及活性测定：RIN-m细胞呈长梭型,折光性好。台盼蓝染色细胞活力为93%左右,细胞活性高。 (2)AngⅡ对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响：不同浓度AngⅡ干预12h各处理组间胰岛素mRNA表达无显著性差异(F=0.324,P=0.858)；干预24h及36h,各处理组胰岛素mRNA表达差异有统计学意义(F=25.622,P=0.000；F=26.405,P=0.000)。24h及36h时,除0.1nMAngⅡ组外,其余三组胰岛素mRNA表达显著低于空白对照组(P值均0.001)。空白对照组和0.1nMAngⅡ组干预不同时间胰岛素mRNA表达无显著性差异(F=0.204,P=0.819；F=1.422,P=0.291),其他三组干预12h胰岛素mRNA表达显著高于24h及36h(P值均0.05),而24h与36h之间差异无统计学意义(P值均0.05) (3)氯沙坦预处理对RIN-m细胞胰岛素基因表达的影响：空白对照组、100nMAngⅡ组及氯沙坦预处理组三组间胰岛素mRNA表达有显著性差异(F=13.791,P=0.002),100nMAngⅡ组胰岛素mRNA表达明显低于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值分别为0.001,0.002),后两者之间差异无统计学意义(P=0.850)。 (4)氯沙坦预处理对RIN-m细胞内ROS水平的影响：三组间ROS水平有显著性差异(F=36.693,P=0.000),100nMAngⅡ组ROS水平明显高于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值均为0.000),后两者之间差异无统计学意义(P=0.258)。 (5)氯沙坦预处理对RIN-m细胞PDX-1及MafA mRNA表达的影响：三组间PDX-1及MafA mRNA表达有显著性差异(F=4.832,P=0.038；F=5.823,P=0.024),100nMAngⅡ组PDX-1及MafA mRNA表达明显低于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值分别为0.016,0.046；0.010,0.030),后两者之间差异无统计学意义(P值分别为0.542,0.530)。 (6)氯沙坦预处理对RIN-m细胞PDX-1及MafA蛋白表达的影响：三组间PDX-1及MafA蛋白表达均有显著性差异(F--9.118,P=0.007；F=16.472,P=0.001),100nMAngⅡ组PDX-1及MafA蛋白表达明显低于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值分别为0.004,0.006；0.000,0.001),后两者之间差异无统计学意义(P值分别为0.802,0.477)。 结论： (1)AngⅡ时间、浓度依赖性抑制胰岛p细胞胰岛素mRNA表达； (2)AngⅡ刺激胰岛p细胞产生大量ROS,诱导p细胞发生氧化应激损伤； (3)AngⅡ下调胰岛p细胞关键转录因子PDX-1及MafA mRNA及蛋白表达； (4)氯沙坦预处理可以拮抗AngⅡ的效应：促进胰岛素mRNA表达,减少p细胞ROS产生,上调PDX-1及MafA mRNA及蛋白表达； (5)AngⅡ可能通过氧化应激途径下调β细胞PDX-1及MafA活性,进而抑制β细胞胰岛素基因表达；氯沙坦预处理可以拮抗AngⅡ对p细胞的氧化应激损伤,从而在胰岛素基因表达方面对β细胞起到保护作用。 第二部分：AngⅡ对RIN-m细胞胰岛素分泌功能的影响及相关机制 目的： 探讨AngⅡ对RIN-m细胞胰岛素分泌功能的影响及其相关分子机制。 方法： (1)AngⅡ对RIN-m细胞胰岛素分泌的影响：实验分为五组,具体分组同第一部分(2)。细胞处理完毕后,37℃,5%C02培养箱中孵育12h、24h或36h,分别用含3.3mM葡萄糖和16.7mM葡萄糖的KRBH液刺激1h,放射免疫法检测胰岛素分泌量。 (2)氯沙坦预处理对RIN-m细胞胰岛素分泌的影响：实验分为三组,具体分组同第一部分(3)。干预24h,放射免疫法检测各组细胞胰岛素分泌量,操作步骤同上。 (3)氯沙坦预处理对RIN-m细胞UCP2 mRNA及蛋白表达的影响：具体分组及处理第一部分(3)。干预24h,RT-PCR检测细胞UCP2 mRNA表达,Western-blot检测细胞UCP2蛋白的表达。 (4)氯沙坦预处理对RIN-m细胞线粒体膜电位的影响：具体分组及处理同第一部分(3)。干预24h,5μg/ml罗丹明123荧光探针负载后流式细胞仪检测平均荧光强度,反映细胞线粒体膜电位。 (5)氯沙坦预处理对RIN-m细胞内ATP含量的影响：具体分组及处理同第一部分(3)。干预24h,每孔加入100μl Celltiter-GloTM混合液,发光计检测萤光强度,反映细胞内ATP含量。 (6)氯沙坦预处理对RIN-m细胞内Ca2+浓度的影响：具体分组及处理同第一部分(3)。干预24h,5μM Fluo-3AM荧光探针负载后流式细胞仪检测Fluo-3平均荧光强度,反映细胞内Ca2+浓度。 结果： (1)AngⅡ对RIN-m细胞基础胰岛素分泌的影响：不同浓度AngⅡ干预12h各处理组间基础胰岛素分泌量无显著性差异(F=0.029,P=0.998)。干预24h及36h,各处理组基础胰岛素分泌量差异有统计学意义(F=5.862,P=0.011；F=12.468,P=0.001)。24h时,除0.1nMAngⅡ组和1nMAngⅡ组,其他两组胰岛素分泌显著低于空白对照组(P值均0.05)。36h时,除0.1nMAngⅡ组外,其他三组胰岛素分泌量显著低于空白对照组(P值均0.05)。空白对照组和0.1nMAngⅡ组在不同干预时间基础胰岛素分泌量无显著性差异(F=0.029,P=0.971；F=1.422,P=0.291),其他三组干预12h胰岛素分泌量显著高于24h和36h(P值均0.05),而24h与36h之间差异无统计学意义(P值均0.05)。 (2)AngⅡ对RIN-m细胞GSIS的影响：不同浓度AngⅡ干预12h各处理组间GSIS无显著性差异(F=2.335,P=0.126)。干预24h及36h,各处理组GSIS差异有统计学意义(F=5.639,P=0.000;F=17.916,P=0.000)。24h时,除0.1nMAngⅡ组外,其他三组GSIS显著低于空白对照组(P值均0.05)。36h时,各处理组GSIS显著低于空白对照组(P值均0.05)。除空白对照组外,其他四组在不同干预时间GSIS有显著性差异(P值均0.05),干预12hGSIS显著高于24h和36h(P值均0.05),而24h与36h之间差异无统计学意义(P值均0.05)。 (3)氯沙坦预处理对RIN-m细胞胰岛素分泌的影响：空白对照组、100nMAngⅡ组及氯沙坦预处理三组间基础胰岛素分泌及GSIS均有显著性差异(F=28.785,P=0.000; F=63.341,P=0.000),100nMAngⅡ组基础胰岛素分泌和GSIS明显低于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值均0.05),后两者之间差异无统计学意义(P值分别为0.611和0.399)。 (4)氯沙坦预处理对RIN-m细胞UCP2 mRNA和蛋白表达的影响：三组间UCP2mRNA和蛋白表达有显著性差异(F=694.903,P=0.000;F=117.157,P=0.000), 100nMAngⅡ组UCP2 mRNA和蛋白表达明显高于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值均为0.000),后两者之间差异无统计学意义(P分别为0.181和0.153)。 (5)氯沙坦预处理对RIN-m细胞线粒体膜电位的影响：三组间线粒体膜电位有显著性差异(F=361.163,P=0.000),100nMAngⅡ组线粒体膜电位明显低于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值均为0.000),后两者之间差异无统计学意义(P=0.107)。 (6)氯沙坦预处理对RIN-m细胞内ATP含量的影响：三组间细胞内ATP含量有显著性差异(F=10.094,P=0.001),100nMAngⅡ组ATP含量明显低于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值分别为0.000,0.001),后两者之间差异无统计学意义(P=0.634)。 (7)氯沙坦预处理对RIN-m细胞内Ca2+浓度的影响：三组间细胞内Ca2+浓度含量有显著性差异(F=7.506,P=0.003),100nMAngⅡ组Ca2+浓度明显低于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值分别为0.001,0.020),后两者之间差异无统计学意义(P=0.198)。 结论： (1)AngⅡ时间、浓度依赖性抑制胰岛β细胞基础胰岛素分泌和GSIS； (2)AngⅡ上调胰岛β细胞UCP2 mRNA及蛋白表达,降低线粒体膜电位,减少细胞内ATP含量和Ca2+浓度； (3)氯沙坦预处理可以拮抗AngⅡ的效应：恢复β细胞基础胰岛素分泌及GSIS,下调UCP2表达,增加线粒体膜电位、细胞内ATP含量及Ca2+浓度； (4)AngⅡ可能通过影响β细胞胰岛素基因表达进而损伤基础胰岛素分泌功能；AngⅡ可能经氧化应激途径上调β细胞UCP2表达,进而损伤GSIS功能；氯沙坦预处理可以拮抗AngⅡ效应,从而在胰岛素分泌功能方面对β细胞起到保护作用。 第三部分：AngⅡ对RIN-m细胞增殖及凋亡的影响及相关机制 目的： 探讨AngⅡ对RIN-m细胞增殖及凋亡的影响及其相关分子机制。 方法： (1)AngⅡ对RIN-m细胞增殖活性的影响：实验分为五组,具体分组同第一部分(2)。各组处理完毕后,在37℃,5%CO2培养箱中分别孵育24h、36h或48h,MTT法检测细胞增殖活性。 (2)氯沙坦预处理对RIN-m细胞增殖活性的影响：实验分为三组,具体分组同第一部分(3)。干预48h,MTT法检测细胞增殖活性。 (3)透射电镜观察各组细胞超微结构：具体分组同第一部分(3)。干预48h,戊二醛固定,酒精脱水,氧化丙烯浸泡,树脂包埋,超薄切片机切片后透射电子显微镜观察。 (4)氯沙坦预处理对RIN-m细胞凋亡率的影响：具体分组同第一部分(3)。干预48h,AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡率。 (5)氯沙坦预处理对RIN-m细胞Bcl-2及Bax表达的影响：具体分组同第一部分(3)。干预48h,RT-PCR检测各组细胞Bcl-2及Bax mRNA表达,Western-blot检测各组细胞Bcl-2及Bax蛋白的表达。 (7)氯沙坦预处理对RIN-m细胞Caspase9、3活性的影响：具体分组同第一部分(3)。干预48h,分光光度法检测细胞Caspase9、3的活性。 结果： (1)AngⅡ对RIN-m细胞增殖活性的影响：不同浓度AngⅡ干预24h、36h及48h,各处理组间细胞增殖活性均有显著性差异(F=288.043,P=0.000；F=198.079,P=0.000；F=201.157,P=0.000)。24h时,除空白对照组与0.1nMAngⅡ组之间无显著性差异(P=0.167),其余各组之间两两比较均有显著性差异(P值均0.05)。36h及48h时,各组之间两两比较均有显著性差异(P值均0.05)。除空白对照组外,其他四组在不同的干预时间细胞增殖活性差异均有统计学意义(F=47.992,P=0.000；F=20.001,P=0.002；F=98.937,P=0.000;F=48.778,P=0.000),24h细胞增殖活性显著高于36h和48h(P值均0.05),而36h与48h之间差异无统计学意义(P值均0.05) (2)氯沙坦预处理对RIN-m细胞增殖活性的影响：空白对照组、100nMAngⅡ组及氯沙坦预处理三组间细胞增殖活性有显著性差异(F=896.424,P=0.000),100nMAngⅡ组细胞增殖活性明显低于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值均为0.000),后两者之间差异无统计学意义(P=0.220)。 (3)透射电镜观察各组细胞形态：空白对照组细胞大小正常,结构清晰,核仁明显,染色质均匀,细胞器正常；100nMAngⅡ组细胞呈现凋亡形态学改变：胞质浓缩,核固缩、碎裂,染色质浓缩、边聚,胞浆有空泡化,线粒体肿胀,嵴明显减少,形成电子透亮区；氯沙坦预处理组细胞形态、结构基本正常。 (4)氯沙坦预处理对RIN-m细胞凋亡率的影响：三组间细胞凋亡有显著性差异(F=101.298,P=0.000),100nMAngⅡ组细胞凋亡率明显高于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值均为0.000),后两者之间差异无统计学意义(P=0.459)。 (5)氯沙坦对预处理RIN-m细胞Bcl-2及Bax mRNA及蛋白表达的影响：三组间细胞Bcl-2 mRNA及蛋白表达均无显著性差异(F=2.180,P=0.169；F=0.622,P=434.795)。Bax mRNA及蛋白表达均有显著性差异(F=57.535,P=0.000；F=434.795,P=0.000);100nMAngⅡ组Bax mRNA及蛋白表达明显高于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值均为0.000),后两者之间差异无统计学意义(P值分别为0.225和0.108)。 (6)氯沙坦预处理对RIN-m细胞Caspase9、3活性的影响：三组RIN-m细胞Caspase9和Caspase3活性有统计学差异(F=5.108,P=0.012；F=5.401,P=0.009)。100nMAngⅡ组细胞Caspase9,3的活性显著高于空白对照组和氯沙坦预处理组(P值分别为0.026,0.004；0.025,0.003),后两者之间差异无统计学意义(P值分别为0.477和0.420)。 结论： (1)AngⅡ时间、浓度依赖性抑制胰岛β细胞增殖活性； (2)AngⅡ诱导β细胞发生典型的凋亡形态学改变,促进β细胞凋亡； (3)AngⅡ对Bcl-2表达没有影响,上调Bax mRNA及蛋白表达,Bax/Bcl-2比值增加,促进Caspase9、3活化； (4)氯沙坦预处理可以拮抗AngⅡ的效应：促进β细胞增殖,抑制β细胞凋亡下调Bax表达,Bax/Bcl-2比值减少,抑制Caspase9、3活化； (5)AngⅡ可能经氧化应激途径上调凋亡基因的表达及活化Caspase,进而经线粒体途径诱导β细胞凋亡；氯沙坦预处理可以拮抗AngⅡ效应,从而在胰岛增殖及凋亡方面对β细胞起到保护作用。

【关键词】：血管紧张素Ⅱ 肾素-血管紧张素系统 β细胞 氯沙坦 氧化应激
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R587.1
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