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《南方医科大学》 2010年
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改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞及大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养表型转化的研究

万波  
【摘要】: 研究背景 勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是指性交时阴茎不能获得勃起或维护勃起以满足性生活,病程3个月以上者。据报道,52%的40~70岁男性存在不同程度的ED,到2025年,全世界大约有3.22亿男性存在勃起功能障碍的问题。ED给患者带来三大危害:精神障碍,心身痛苦;降低对生活的满意度;影响家庭的和睦、幸福和稳定。因此,男子勃起功能障碍越来越受到专家、学者和社会的关注。 阴茎海绵体是一种特殊的血管组织,正常阴茎海绵体由网络状海绵体小梁和小梁间隙所构成。海绵体小梁由大量平滑肌细胞组成,其间散布有胞外胶原基质,血供丰富而神经纤维成分相对较少。小梁间有许多相互沟通的窦间隙,由内皮细胞衬附。海绵窦由小梁间隙汇合而成。平滑肌细胞是阴茎海绵体主要的收缩与松弛成分。正常情况下,阴茎海绵体平滑肌细胞上不仅有丰富的肾上腺素能受体、胆碱能受体,而且还含有多种非肾上腺素能非胆碱能受体,作为勃起组织中最主要的舒张-收缩成分,是组成阴茎勃起功能的主要承担者。在病理条件下,阴茎勃起组织中阴茎海绵体平滑肌细胞减少与ED的发生关系密切,且与临床表现的严重程度一致。许多研究发现ED的发生与病理状态下海绵体中阴茎海绵体平滑肌细胞减少、胶原纤维的堆积有密切关系。而这些病理变化与阴茎海绵体平滑肌细胞的病理改变有不可分割的联系,因为平滑肌是合成胶原的关键所在。越来越多的研究发现,阴茎海绵体平滑肌细胞有可能直接参与ED发生时阴茎海绵体纤维化的启动与调控。近年来,对ED的发生机制研究深入分子水平,例如NO-cGMP通路、离子通道、细胞间通讯及细胞上各种酶和受体的表达等。研究这些分子机制所需的材料主要来自于体外培养的阴茎海绵体平滑肌细胞,Christ等学者对阴茎海绵体平滑肌细胞进行体外培养组织块法进行过研究,并对阴茎勃起障碍的发病机制及治疗进行了有益的探讨,但未对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞的体外培养其它方法进行过研究,也缺乏对体外培养的阴茎海绵体平滑肌细胞纯度的分析,而足够纯度的阴茎海绵体平滑肌细胞是在细胞水平研究勃起功能机制的前提条件。 为了体外培养建立高纯度阴茎海绵体平滑肌细胞,我们通过改良组织块法,成功建立较高纯度原代阴茎海绵体平滑肌细胞,再通过差速贴壁法纯化传代,得到更高纯度的阴茎海绵体平滑肌细胞。 平滑肌细胞表型转化是指:平滑肌细胞在生理、病理情况下发生的分化及去分化表现,是机体发育的不同阶段或不同疾病状态下平滑肌细胞所发生的形态、结构和功能的改变。平滑肌细胞与骨骼肌细胞和心肌细胞不同,平滑肌细胞的分化呈可逆状态,根据结构和功能的不同,平滑肌细胞可分为收缩型(分化型)和合成型(去分化型)两种类型,收缩型的功能顾名思义是收缩,而合成型主要功能是增生、迁移、分泌及调节胞外蛋白等。要研究平滑肌细胞是否存在表型转化,首先要区分平滑肌细胞不同的表型状态。不同表型的平滑肌细胞分别会表达一些不同的表型标志物和标志基因,当平滑肌细胞发生表型转化时,这些标志物的表达会相应的改变。收缩型平滑肌细胞包含有以下几种标志物:平滑肌α肌动蛋白(smooth muscleα-actin,α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chains, SM-MHC)、碱性调宁蛋白(calponin 1)及钙调节蛋白(h-caldesmon)等。肌动蛋白和肌球蛋白,作为主要的结构蛋白,在发育过程中出现得非常早,而h-caldesmon和calponin 1作为调节蛋白,能够作为平滑肌细胞更高分化阶段的标志物。而骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是机体发育过程中或某些病理状态下主要由间叶组织细胞分泌到细胞外基质中的一种酸性糖蛋白,研究表明,OPN是血管平滑肌由收缩型向合成型转化的标志物,合成型平滑肌细胞高表达OPN。calponin 1表达减少或者OPN表达增多提示平滑肌细胞由收缩型向合成型转化。 阴茎海绵体组织被认为是一类特殊的血管组织,其小梁平滑肌与心血管平滑肌在结构和功能上具有相似性,本课题组前期实验已经证实高血压勃起功能障碍及糖尿病勃起功能障碍大鼠海绵体平滑肌细胞存在表型转化。 正是在以上基础上我们设计了本课题的第二部分研究,根据calponin 1是收缩型平滑肌细胞的标志物,OPN是合成型平滑肌细胞的标志物,在基因水平上比较各组大鼠阴茎海绵体calponin 1 mRNA和OPN mRNA的相对表达量,进一步了解正常SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养是否存在表型转化。 目的 通过改良组织块法培养得到较高纯度的原代阴茎海绵体平滑肌细胞,进一步差速贴壁法进行细胞纯化及传代,得到更高纯度的阴茎海绵体平滑肌细胞。在此基础上,根据血管平滑肌表型转化的相关理论,通过检测阴茎海绵体平滑肌不同表型标志物的含量,以了解正常SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养是否存在表型转化,并选取合适的代数细胞,以获得纯度更高、功能良好阴茎海绵体平滑肌细胞。 方法 1.将15只SPF级2月龄SD雄性大鼠统一饲养在昼夜节律为12h、保持一定温度和湿度的空间,给予自来水、饲高蛋白饲料喂养,称体重,给予一个三位数的随机数,然后按从小到大排序,前5只分在组织块法组,中间5只分在酶法组,后5只分在改良组织块法组,然后给予阿朴吗啡(apomorphine, APO) (100μg/kg)皮下注射,观察并计数给药后30min内每只大鼠阴茎勃起次数。剔除勃起功能障碍大鼠。三组大鼠分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察并记录细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型,利用SPSS 13.0统计软件分析数据,数据均以(?)±s表示,均数比较采用one-wayANOVA,两两比较采用LSD方法,P值0.05为有统计学意义。 2.将第一部分实验中改良组织块法获得的原代阴茎海绵体平滑肌细胞经差速贴壁传代到第六代,留原代细胞,第二代细胞,第四代细胞,第六代细胞使用。根据calponin 1是收缩型平滑肌细胞的标志物,OPN是合成型平滑肌细胞的标志物,Q-PCR分析各组大鼠阴茎海绵体calponin 1 mRNA和OPN mRNA的相对表达量,比较四组大鼠各种标志物的表达量。利用SPSS13.0软件,按多样本均数比较的方差分析处理数据,运用LSD法进行多重比较。因为calponin 1 mRNA相对表达量各组间方差不齐(F=5.431,P=0.009)和OPN mRNA相对表达量各组间方差不齐(F=5.131,P=0.011),采用Welch近似方差分析,采用Tambane'sT2法进行多重比较。P0.05为统计学差异显著。 结果 1.15只SD雄性大鼠勃起功能均正常。 2.α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。 3.在体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中,calponin 1 mRNA表达情况为:各代数组间的calponin 1 mRNA存在显著性差异(F=337.342,P=0.000),第六代阴茎海绵体平滑肌细胞组的calponin 1 mRNA均小于其余三组(P均小于0.05)。第四代阴茎海绵体平滑肌细胞组的calponin 1 mRNA小于原代组和第二代组(P均小于0.05)。第二代组阴茎海绵体平滑肌细胞组的alponin 1 mRNA与原代组未见显著差异(P=0.072);OPN mRNA表达情况为:各代数组间的OPN mRNA存在显著性差异(F=125.572,P=0.000),第六代阴茎海绵体平滑肌细胞组的OPN mRNA均大于其余三组(P均小于0.05)。第四代阴茎海绵体平滑肌细胞组的OPN mRNA大于原代组和第二代组(P均小于0.05)。第二代组阴茎海绵体平滑肌细胞组的OPN mRNA与原代组未见显著差异(P=0.094)。 结论 1、结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标; 2、改良组织块法较组织块法和酶法可获纯度更高的阴茎海绵体平滑肌细胞; 3、阴茎海绵体平滑肌的收缩结构与心血管系统的平滑肌具有相似性; 4、SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养存在表型由收缩型向合成型转化,CCSM是一种很容易去分化的细胞,体外培养至第4代,即可从典型的收缩表型转化为合成表型; 5、体外CCSM的研究取改良组织块法培养,经差速贴壁得到的第二代细胞纯度更高,细胞功能更好。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R698

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