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《南方医科大学》 2010年
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补阳还五汤改善慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的研究

李齐欢  
【摘要】: 1.研究目的 补阳还五汤(Buyang Huanwu Decoction,BYHWD)出自清·王清任的《医林改错》,该方由生黄芪、当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙七味中药组成,具有补气行气、活血化瘀、通经活络之功效。此方为后世医家所推崇,沿用至今已170多年。现该方广泛应用于缺血性脑损伤、脊髓及周围神经损伤。近年实验研究表明,补阳还五汤能够从多靶点、多环节改善缺血再灌注的损伤。为了探讨补阳还五汤对慢性脑缺血所致学习记忆能力降低的作用靶点及防治机理,阐明补阳还五汤促进神经损伤修复,改善学习记忆能力的临床应用价值,为传统中药复方的临床应用提供新的实验依据,我们对补阳还五汤进行了以下研究。 2.方法与结果 2.1慢性脑缺血大鼠造模、分组及给药方法 采用永久性结扎大鼠双侧颈总动脉法(2-VO)对大鼠进行慢性脑缺血造模,这种方法实质上是以慢性低灌注引起脑缺血缺氧,最终导致神经细胞功能下降、学习记忆能力障碍,较好地模拟了人类因动脉粥样硬化、动脉管腔狭窄等因素导致的脑缺血梗死。本实验选用SPF级、雄性、体重180-220g的SD大鼠进行2-VO造模。手术前大鼠禁食12h(禁食不禁水)后,腹腔注射水合氯醛(0.35 g/kg)进行麻醉,将麻醉后大鼠仰卧固定手术台上,颈部皮肤剪毛备皮,用碘酒及75%乙醇消毒,于颈前正中切开皮肤及皮下组织,长度约1.5cm,在颈前肌肉和侧方肌肉间隙分离双侧颈总动脉、迷走神经,双重丝线结扎双侧颈总动脉,然后缝合,伤口撒磺胺灭菌粉预防感染。假手术组10只大鼠不做结扎其它步骤同模型组。大鼠术后3周进入慢性缺血期,然后在第4周进行Morris水迷宫初筛。根据水迷宫初筛结果对造模成功的大鼠随机分为4组(每组10只):模型对照组、补阳还五汤低量组、补阳还五汤高剂量组,阳性对照药组。给药方式:假手术组(给予等体积的生理盐水)、模型对照组(给予等体积的生理盐水)、补阳还五汤低量组(20g/kg/d)、补阳还五汤高剂量组(40g/kg/d),阳性对照药组(金纳多片,0.045g/kg/d),连续给药四周。 2.2补阳还五汤对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的影响 为了探讨补阳还五汤对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力下降的影响,本课题利用Morris水迷宫实验(morris water maze test)和穿梭箱实验对造模后大鼠学习记忆能力进行实验。Morris水迷宫实验包括定位航行试验(Place navigation test,PNT)及空间搜索试验(Spatial probetest,SPT)。定位航行试验历时4 d,每天训练一循环次,每个循环训练4次。训练时随机选择一个入水点,将大鼠面向池壁放入水中,观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间。结果发现各组动物寻找平台的潜伏期逐渐缩短,其中,模型对照组与假手术对照组比较,在训练的第一二、三天的潜伏期时间有显著性差异(P0.05);与模型对照组比较,补阳还五汤高剂量组和阳性药对照组在第一天,补阳还五汤低剂量组在第一、二、三天均有显著性差异(P0.05)。空间搜索试验:用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的能力。即在第5d时,撤除平台,然后任选二个入水点将大鼠面向池壁放入水中,记录大鼠在120 s内穿过原平台所在位置的次数。结果显示模型对照组、补阳还五汤高、低剂量组和阳性药对照组的穿越平台数分别降至假手术对照组的42.46%、56.16%、64.38%、76.71%,其中模型对照组与假手术对照组比较有显著性差异(P0.05),与模型对照组比较,各给药组大鼠的平台空间位置记忆能力较模型对照组的明显增强,其中阳性对照组的有显著性差异(P0.05)。 穿梭箱实验利用实验箱自动记录各组大鼠对电刺激的反应和潜伏期。记录动物主动回避次数,动物主动回避时间,动物被动回避时间。结果显示在四次测试中,各组别动物主动回避次数和主动回避时间呈先增加而后稍减少的趋势,补阳还五汤各剂量组和阳性药对照组的次数和时间较模型对照组的增加,被动回避时间呈先减少而后增加的趋势,但均无显著性差异。 根据Morris水迷宫实验和穿梭箱实验结果,提示补阳还五汤能改善造模后大鼠的学习能力,增强大鼠记忆力。 2.3补阳还五汤改善脑缺血损伤学习记忆能力的机理研究 2.3.1皮层血流量测定为了探讨补阳还五汤对慢性脑缺血大鼠脑血流量的影响,本课题使用大鼠脑立体定位仪对各组大鼠皮层血流量进行测量比较。结果除假手术组外各剂量组脑血流量均明显下降,模型对照组、补阳还五汤高、低剂量组、阳性药对照组皮层血流值分别下降至假手术组的50.22%(P0.05)、73.90%、67.30%、75.65%,但补阳还五汤各剂量组和阳性药对照组脑血流量下降程度明显小于模型对照组,与模型对照组比较,补阳还五汤高剂量组和阳性药对照组与其均有显著性差异(P0.05),且补阳还五汤对脑血流量的改善程度随剂量增大而增强。提示补阳还五汤能够明显改善慢性脑缺血大鼠脑血流量下降程度,改善慢性脑缺血大鼠大脑缺血状态。 2.3.2血液流变学测定慢性脑缺血伴血液流变性改变,表现在全血、血浆黏度升高,血小板聚集率增大,压积增高,血浆纤维蛋白原升高等。木实验采用血液流变仪测定各组大鼠全血高、中、低切粘度,观察补阳还五汤对慢性脑缺血大鼠血流变的影响。结果显示与假手术对照组比较,模型对照组全血粘度明显增加,其中在切变率150、30、5s-1时有显著性差异(P0.05);与模型对照组比较,补阳还五汤各剂量组和阳性药对照组均能降低全血粘度,从而降低脑组织缺血造成的血液流变学异常对脑组织的损伤,其中补阳还五汤高剂量在切变率1 s-1、补阳还五汤低剂量在切变率150、30、5、1 s-1时有显著性差异(P<0.05)。提示补阳还五汤能够降低血液粘度,改善脑缺血状态。2.3.3对慢性脑缺血组织形态改变的影响比较各组大鼠脑缺血对脑组织形态的改变,观察补阳还五汤对慢性脑缺血脑组织改变的影响。实验按操作规程对脑组织标本进行苏木素伊红(HE)染色和焦油紫染色。结果: HE染色: (1)假手术组:细胞周围间隙正常,形态规则,海马CAl区细胞层次排列整齐。 (2)模型组:脑组织疏松,顶叶皮质轻度缺血性改变,神经元减少,细胞排列松散,细胞外空隙增大,毛细血管周围出现明显间隙,海马CAl区神经细胞数目明显减少,排列紊乱,无层次感,部分细胞固缩深染。 (3)给药组:阳性对照组和补阳还五汤低、高剂量组大鼠皮层神经元数目稍有增加,形态不规则,海马CAl区神经细胞层次排列稍混乱,神经细胞体积略缩小。 焦油紫染色: (1)假手术组:细胞形态规则,细胞质内焦油紫丰富,着色均匀,周边尼氏体着蓝色,细胞核空不着色,核仁着色,海马CAl区细胞层次排列整齐,分为4-5层,细胞外周围组织间隙正常。 (2)模型组:皮层锥体细胞体积缩小,形态不规则,固缩呈深紫色,细胞和血管周围间隙明显增大。海马CAl区神经细胞稀疏,排列紊乱无层次感,部分胞质尼氏体明显减小,甚至消失,部分细胞固缩成紫色。 (3)给药组:阳性对照组和补阳还五汤低、高剂量组大鼠海马CAl区神经细胞约2-3层,层次排列稍紊乱,神经细胞体积略缩小,形态不规则,着色不均匀,尼氏体减少。 提示补阳还五汤能保护慢性脑缺血大鼠海马CAl区神经细胞,能降低神经细胞死亡。 2.3.4对脑组织PAF含量的影响采用酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测脑组织PAF含量。结果显示,与假手术对照组比较,模型对照组、补阳还五汤各剂量组和阳性药对照组脑组织PAF含量显著升高,有显著性差异(P0.01),与模型对照组比较,补阳还五汤高、低剂量和阳性药对照组脑组织PAF含量显著降低,有显著性差异(P0.01)。结果表明补阳还五汤能通过降低脑组织PAF释放,减低炎症反应,改善慢性脑缺血状态。 3结论 3.1补阳还五汤具有明显改善慢性脑缺血大鼠的应激学习能力,增强其学习记忆能力。 3.2补阳还五汤明显改善慢性脑缺血大鼠的应激学习能力和学习记忆力的机理与以下因素有关:明显改善模型大鼠脑血流量的下降程度,改善其大脑缺血状态;降低模型大鼠的血液粘度,改善脑组织的血流灌注;保护模型大鼠海马CAl区神经细胞,改善神经细胞的死亡;降低模型大鼠脑组织PAF释放,减轻模型大鼠脑组织炎症反应,改善PAF激发的炎症级联放大效应对慢性脑缺血模型大鼠的脑组织继发性损伤。 3.3本文提示补阳还五汤通过多环节、多靶点的作用明显改善慢性脑缺血大鼠的脑缺血状态、降低血液粘度、保护神经细胞、抑制脑组织缺血后PAF激发的炎症继发性损伤,从而改善慢性脑缺血损伤所致的学习记忆能力下降,为补阳还五汤改善脑缺血导致的学习记忆能力下降提供了新的实验依据。
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285.5

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