大肠杆菌K1致病株外膜蛋白T毒力相关功能研究

【摘要】： 大肠杆菌是存在于人和许多动物肠道中的优势菌群,主要寄生在大肠内,属于肠道正常菌群成员之一,某些血清型菌株的致病性强,可引起腹泻等肠道内感染,另一类大肠杆菌在一定条件下可引起肠道外感染,称之为肠外致病性大肠杆菌,可引起泌尿系统感染,败血症和脑膜炎等。 大肠杆菌是最常见的致新生儿脑膜炎的G菌,已经有超过100个K荚膜抗原被鉴定,但新生儿大肠杆菌脑膜炎分离株中,带有K1荚膜多糖的大肠杆菌株约占80%,这些分离株本身属于肠道的正常菌群并已知存在于产道。大多数新生儿和儿童的脑膜炎发病是血源性传播的结果,很多研究表明菌血症的水平与脑膜炎的发病相关。细菌的侵入起始于脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMEC),这是构成血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的主要组成细胞。前期的体外研究实验表明大肠杆菌体外穿越BBB而没改变BMEC单层的完整性。体内研究表明,脑膜炎的发病进展导致了BBB透过性的改变,并诱发脑膜炎,这种透过性的改变所涉及的机制可能是多因素的。越来越多的研究表明黏附和随后侵入BMEC涉及病原体和宿主多因子的参与,但又是两个相对独立的过程。随着BMEC体外模型及脑膜炎动物模型的建立,多个大肠杆菌K1株特异的菌体蛋白被鉴定,如IbeA, IbeB, IbeC, IbeT, YijP, CglD为侵入BMEC所需要的。一些大肠杆菌常见的菌体结构和蛋白也被证实与毒力有关,如荚膜、菌毛、外膜蛋白等。此外,S菌毛结合蛋白和IbeA的多个受体在BMEC表面也得到鉴定。 大肠杆菌外膜蛋白T,是定位于大肠杆菌外膜的一种蛋白酶。OmpT在体外引起重组蛋白的降解而引起人们的注意,甚至是在高浓度尿素极端变性的情况下依旧保持活性,目前商品化的大肠杆菌表达宿主都是ompT缺陷型。虽然研究者很早就已将OmpT进行柱层析纯化,并对其基因进行克隆测序,但对其在体内的功能知之甚少。有研究表明ompT在脑膜炎致病株中的分布高达96%,远远高于其它典型的脑膜炎致病毒力基因。关于ompT在脑膜炎发病机制中的作用还不清楚,ompT是否参与介导菌体侵袭及相关毒力机制还有待研究。近年越来越多的研究表明,OmpT不仅具有蛋白酶活性,还可能与细菌感染相关,携带ompT基因在粪来源的大肠杆菌中十分常见,但流行病学分析表明尿路感染大肠杆菌分离株ompT基因的检测率更高,显著高于其它来源菌株。因此ompT是假定的尿路感染毒力因子,但一直缺少实验依据直接证实其与尿路感染发病相关。外膜蛋白作为大肠杆菌高度保守的蛋白家族,其在微生物感染中的作用越来越引起研究关注。 虽然只有很少的OmpT天然底物被鉴定,但我们可以通过其降解重组表达蛋白的情况来推测其生理功能,可能包括分泌型蛋白,尤其是一些毒力蛋白的加工成熟及胞内外源蛋白的降解。OmpT活性结构域位于菌体外膜,优先识别并水解连续的碱性氨基酸残基形成的肽键,因而推测其在抵抗阳离子抗菌肽杀伤菌体细胞方面起着重要的作用,这些有利于侵入机体内的大肠杆菌更好的存活。已证实大肠杆菌外膜成分可以体外激活人血纤溶酶原,由于OmpT在结构及功能上与鼠疫耶尔森菌的外膜纤溶酶原激活剂Pla蛋白有着很高的同源性(47%),OmpT也被推测是一种纤溶酶原激活剂。与纤溶酶系统的作用有利于细胞外基质的降解、菌体扩散及向深部组织侵袭。 OmpT作为一种多功能蛋白酶,推测应该以一种混合机制参与致病。一是通过发挥蛋白酶活性,参与毒力因子前体的加工,降解细胞分泌的抗菌肽等；二是通过激活纤溶酶原降解细胞外基质促进侵袭,这其实也与OmpT酶活相关；三是可能与一些毒力基因的表达调控相关,这方面在霍乱弧菌中的研究较深入。 本文为了研究ompT基因在大肠杆菌K1株感染中的毒力机制,利用染色体同源重组构建了大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因敲除株,人BMEC单层细胞体外BBB模型显示,ompT基因敲除导致大肠杆菌K1株体外黏附及侵袭BMEC能力降低,OmpT低表达水平质粒可以基本回补突变株黏附能力至野生株水平；OmpT的表达可增强菌株的细胞毒效应；血源扩散乳鼠脑膜炎动物实验证实,ompT基因敲除后菌株突破BBB的能力大大降低；OmpT体外功能研究表明,两步柱层析纯化得到的大肠杆菌K1株外膜蛋白组分可以激活人血纤溶酶原并呈一定量效关系；利用超滤结合阳离子交换层析制备了人尿来源抗菌肽,和野生株相比,ompT基因敲除株对尿阳离子抗菌肽的抵抗能力降低。 一、大肠杆菌K1致病株ompT基因敲除及特性分析 1、为了研究ompT基因在大肠杆菌致病中的毒力相关功能,构建ompT基因敲除株OTD3。以E44基因组为模板,通过OMT-S1和OMT-B1引物PCR扩增得到1.57 kb的片段FOT5,通过OMT-B2和OMT-X2引物PCR扩增得到1.27 kb的片段FOT3,两个DNA片段利用引物引入的BamH I位点连接得到2.84 kb的ompT基因中间缺失片段FOT53。利用SalⅠ及SacⅠ位点连入自杀载体pCVD442,构建重组自杀性质粒pCVT53, pCVT53转化入SM10λpir,与E44野生株接合转移,PCR筛选得到突变株并命名为OTD3,并测序验证基因缺失。 2、K1株E44的ompT基因全长954bp,编码317个氨基酸,前20个氨基酸为信号肽序列,BLAST表明与大肠杆菌K12株OmpT(P09169316氨基酸)有96.2%氨基酸序列同源性,两者仅在肽链C端有部分氨基酸序列存在差异,C末端并不参与构成酶活性中心及维持蛋白特定空间构象。将带有完整ORF的ompT基因序列插入质粒pUC13得到重组质粒pUCT。ompT基因处于lac_promoter的操控,用作回补实验载体。 3、与E44相比,OTD3表现出了微弱的生长优势,E44及OTD3菌体的菌落形成能力并无显著差异。ompT的敲除并未影响大肠杆菌重要黏附素Ⅰ型菌毛的表达。总体上ompT敲除对K1株基本属性无显著影响,因而突变株适用于研究该基因对感染相关毒力的影响。 4、鱼精蛋白是一类天然的阳离子抗菌肽,富含连续的Arg。我们考察了0、0.01、0.1和1 mg/ml的鱼精蛋白对E44生长的影响,高浓度鱼精蛋白直接杀灭菌体,低浓度范围内对菌体生长有抑制作用,且呈一定量效关系。与野生株E44相比,OTD3对0.1 mg/ml的鱼精蛋白敏感,引起生长抑制。同样的结果也在基因工程常用菌株BL21(DE3)、JM109及DH5α中得到证实,ompT+株对鱼精蛋白的杀菌活性表现出了更强的抵抗。鱼精蛋白是OmpT的底物,对其敏感性间接反映了OmpT的表达水平及质粒回补效果,在随后的侵袭相关研究中,利于对比OmpT的表达对侵袭各环节的影响。 二、ompT基因敲除降低大肠杆菌K1株致病能力 1、体外模型采用人BMEC单层细胞,实验前24 h,将BMEC铺至24孔板,待细胞汇合成单层后备用(约105细胞/孔)。待测细菌37℃静置培养24 h至稳定期,PBS适当稀释备用,以OD600估算菌浓,按感染倍数,即细菌数：细胞数约100：1接入待测菌,同时留样涂平板培养计数得确切菌浓。37℃孵育2h后,PBS清洗4次后裂解细胞并涂布LB平板计菌落数,此为黏附的细菌总数,并计算黏附率。侵袭组三个复孔,与100μg/ml庆大霉素37℃孵育1h来杀死所有胞外细菌,PBS清洗4次,裂解细胞涂布LB平板计菌落数,即为胞内菌数,并计算侵袭率。与野生株E441、2和3h的黏附率相比,OTD3黏附BMEC单层细胞能力显著降低。庆大霉素保护实验结果表明,侵袭能力上也表现出了相应比例的降低,侵袭能力降低源于黏附能力的降低。OTD3转化入低OmpT表达水平的回补质粒pGEM-OmpT后,突变株黏附能力基本得到恢复,而OmpT高表达质粒pML19并不能回补突变株黏附能力。推测BMEC表面存在某种OmpT的底物,对其适度的水解利于菌体黏附过程。 2、待测菌37℃静置培养24 h至稳定期,PBS适当稀释后,取约107细菌接入汇合的BMEC单层中,37℃孵育2,4和6h,取上清并测定LDH活性,LDH释放活性大小间接反映了细胞膜的受损程度。与ompT基因缺失株OTD3相比,野生株E44感染后4和6h的细胞毒效应更高。转化了pML19的OTD3,过表达的OmpT介导的细胞毒效应明显高于携带空载体pUC19的野生株E44。与空白对照相比,ompT的非致病株BL21(DE3)与BMEC孵育也可以引起轻微的细胞毒效应,转化了pML19后,BL21(DE3)/pML19的细胞毒效应大幅地提升。不同菌株的细胞毒效应反映了一个趋势,OmpT的表达量与LDH的释放即胞膜损伤正相关,某种程度上证明了BMEC胞膜表面存在着OmpT的作用底物。 3、五日龄的乳鼠被接种同剂量的E44及OTD3,感染18h后,血样及CSF样本涂布LB平板计菌落数。接种ompT基因缺失株OTD3可以引起与野生株E44相似水平的菌血症,23只接种了OTD3的乳鼠只有7只发生脑膜炎(30%),而17只接种了野生株E44的乳鼠当中,12只CSF培养呈阳性,占了71%。ompT基因缺失显著降低了大肠杆菌K1株穿越BBB的能力,与前面BMEC单层培养的体外BBB模型结果相符,综合体内外实验结果,ompT乍为一种辅助毒力因子与菌体侵入BBB相关。 三、大肠杆菌K1株OmpT体外功能 1、裂解E44菌体,膜组分沉淀经反复抽提粗纯化后上样至丝氨酸蛋白酶抑制剂亲合层析柱Benzamidine Sepharose Fast Flow, NaCl梯度洗脱,分段收集并电泳检测,按分子量判断外膜蛋白集中在200 mmol/L NaCl洗脱,此步亲和层析去掉绝大部分杂蛋白；再经SOURCE 30Q强阴离子交换层析进一步精纯,收集约180 mmol/L NaCl洗脱组分,得到较纯的外膜蛋白,主要由二个条带组成,为分子量集中在37 kDa的包括OmpT在内的大肠杆菌外膜组分,可用于随后的体外活性研究。 2、S-2251生色发光底物法测定外膜蛋白对人血纤维蛋白溶酶原(plasminogen, Plg)的激活效应,激活产生的纤溶酶plasmin水解S-2251释放对硝基苯胺(pNA),pNA在405 nm处有强吸收,pNA显色的深浅与激活剂的活性成正比。由于商品化Plg中,残存少量纤溶酶,所以对照组Plg的OD405也呈上升趋势。实验组加入高低两个浓度的E44膜组分,Plg被激活,曲线斜率呈上升趋势,表明Plg不断被激活,且与膜组分的加入量呈一定量效关系。而ompT敲除株OTD3制备的外膜组分不具有体外激活Plg的效应。利用相关毒力因子激活纤溶酶原是普遍存在的病原体突破宿主生理屏障、获取养分及逃避宿主防御机制的策略。 3、采用1 kDa截留分子量的Pellicon超滤膜对尿液中全蛋白进行快速富集,随后采用50 kDa截留分子量的超滤膜按分子量进行分级分离,收集超穿组分即得MW20 kDa的小分子尿蛋白,大分子量尿蛋白被截留。各步纯化组分均用BL21(DE3)作为测定菌株,琼脂糖扩散法测定抗菌活性。结果表明只有小分子尿蛋白组分表现出了明显的抗菌活性。弱阳离子交换CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到尿来源小分子阳离子肽。TSK G2000SWxl凝胶过滤HPLC分析各步分离组分的分子量分布,50 kDa超穿组分分子量呈多峰分布,经过阳离子交换层析后,得到了分子量分布呈单峰的洗脱组分,50 kDa超滤与阳离子交换层析两步即可制备分子量分布均一的尿来源阳离子肽类,代表了正常尿液中存在的抗菌肽类,随后考察了OmpT是否赋予了大肠杆菌对尿抗菌肽的抵抗能力。 4、ompT阳性株表现出更强的抵抗尿抗菌肽杀菌活性的能力。培养过程中加入尿阳离子肽,K1株E44表现出了对抗菌肽更强的抵抗能力,生长速率高于其ompT基因缺失株OTD3, ompT基因的敲除,降低了OTD3抵抗尿抗菌肽的能力。同时我们考察了基因工程常用菌株BL21(DE3)(ompT突变)和DH5α(ompT阳性)的尿来源抗菌肽的敏感性。20μg/ml的尿抗菌肽加入后,BL21(DE3)的生长被完全抑制,甚至被杀灭。pML19回补后,过表达的OmpT抑制了BL21(DE3)/pML19生长的同时,也增强了其对尿阳离子肽的抵抗,但却没有达到DH5α对尿抗菌肽的抵抗能力。结果表明OmpT参与了尿来源阳离子肽类的水解失活。机体各组织细胞尤其是上皮细胞、吞噬细胞等都维持一定水平的抗菌肽表达,在炎症及感染发生时,抗菌肽表达水平会被迅速上调并持续高水平分泌,构成固有免疫的防御系统重要组成部分。病原体会通过各种途径实现对宿主抗菌肽杀菌活性的抵抗,来利于其完成黏附、侵袭过程,并在宿主体内成功存活而导致感染。