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抗CTLA-4抗体对脓毒症小鼠免疫功能及生存率影响的研究

薄禄龙  
【摘要】:【目的】 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4)是淋巴细胞活化与早期增殖的重要抑制分子。CTLA-4在脓毒症病理生理机制中可能发挥重要调节作用,是参与或介导脓毒症免疫抑制的重要分子。本研究拟应用抗CTLA-4抗体治疗脓毒症小鼠,观察其是否可改善脓毒症小鼠生存率,探讨抗CTLA-4抗体对脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡、细胞因子、脾脏淋巴细胞亚群的影响及其潜在机制。 【方法】 1.将62只CD1小鼠随机分为假手术组(n=16)、盲肠结扎穿孔(CLP)术后1 d(n=10)、4 d(n=16)、7 d(n=20)组,各组按相应时间点处死取脾脏,应用流式细胞仪检测CD4~+、CD8~+及调节性T细胞表面CTLA-4表达水平。 2.分别构建CLP、CLP~+白念珠菌感染脓毒症小鼠模型。将36只CLP脓毒症CD1小鼠随机分为治疗组(n=18)与对照组(n=18),治疗组于术后1.5、24 h给予腹腔注射50μg抗CTLA-4抗体,观察脓毒症小鼠7 d生存率;将14只CD1小鼠构建CLP~+白念珠菌感染脓毒症模型,随机分为治疗组(n=7)与对照组(n=7)。治疗组于白念珠菌感染后2、5、7 d给予腹腔注射33μg抗CTLA-4抗体,观察小鼠10 d生存率。 3.将54只CD1小鼠随机分为假手术组(n=11)、假手术~+抗CTLA-4抗体治疗组(n=11)、CLP~+PBS对照组(n=16)、CLP~+抗CTLA-4抗体治疗组(n=16)。抗CTLA-4抗体治疗组于术后6 h、24 h腹腔注射50μg抗CTLA-4抗体,各组小鼠于术后48 h处死取脾脏。应用流式细胞仪检测CD4~+、CD8~+ T细胞Caspase-3表达,应用抗-CD3/CD28共刺激培养脾脏细胞后检测TNF-α、IL-6、IL-10,IFN-γ表达。 4.将28只CD1小鼠随机分为假手术组(n=6)、假手术~+抗CTLA-4抗体组(n=6)、CLP~+PBS对照组(n=8)、CLP~+抗CTLA-4抗体治疗组(n=8)。抗CTLA-4抗体治疗组于术后1、3、5 d腹腔注射50μg抗CTLA-4抗体。各组小鼠于术后7 d处死取脾脏,应用流式细胞仪检测各组小鼠脾脏细胞总数、CD4~+、CD8~+ T细胞数量,初始(CD44low/CD62Lhigh)、中央型记忆(CD44high/CD62Lhigh)、效应型记忆(CD44high/CD62Llow)的CD4~+、CD8~+ T细胞数量。 【结果】 1.CLP脓毒症小鼠术后1、4、7 d时CTLA-4阳性CD4~+ T细胞比例以及术后4 d、7 d时CTLA-4阳性CD8~+ T细胞比例均显著高于假手术组(P均小于0.05)。CLP脓毒症小鼠术后1、7 d时调节性T细胞表面CTLA-4表达均显著高于假手术组(46%, 25% vs. 18%, P0.05);同时,CTLA-4表达的平均荧光强度也高于假手术组(11, 7.5 vs. 5, P0.05)。 2.CLP术后1.5、24 h分别腹腔给予50μg抗CTLA-4抗体可显著提高脓毒症小鼠7 d生存率(33.3% vs. 5%,P0.05)。在CLP~+白念珠菌感染脓毒症模型中,对照组小鼠于CLP术后10 d时全部死亡,抗CTLA-4抗体治疗组小鼠10 d生存率为35% (P0.05)。 3.抗CTLA-4抗体可显著降低CLP脓毒症小鼠Caspase-3阳性CD4~+、CD8~+ T细胞比例,抑制脾脏T细胞凋亡(P0.05)。抗CTLA-4抗体对脓毒症小鼠脾脏细胞分泌IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ水平影响不显著(P0.05)。 4.抗CTLA-4抗体对CLP脓毒症小鼠脾脏初始(CD44low/CD62Lhigh)、中央型记忆(CD44high/CD62Lhigh)、效应型记忆(CD44high/CD62Llow)的CD4~+、CD8~+ T细胞数量影响不显著(P0.05)。 【结论】 CLP小鼠术后CTLA-4阳性CD4~+、CD8~+ T细胞比例显著增高,CTLA-4阳性CD4~+CD25~+Foxp3~+ T细胞比例及其平均荧光强度也增高。抗CTLA-4抗体可显著提高CLP脓毒症小鼠和CLP~+白念珠菌感染脓毒症小鼠的7 d或10 d生存率。抗CTLA-4抗体可显著降低CLP脓毒症小鼠Caspase-3阳性CD4~+、CD8~+ T细胞比例,而对细胞因子表达以及T细胞亚群比例无显著影响,提示抗CTLA-4抗体对脓毒症小鼠的治疗作用可能是通过抑制细胞凋亡途径实现的。


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