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《第二军医大学》 2011年
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Tim-1-Fc抑制同种移植物排斥反应的作用与机制

肖亮  
【摘要】:CD4~+T辅助细胞的活化、增殖和分化是抗原特异性免疫反应产生的关键环节。该反应的产生除了需要抗原递呈细胞(Antigen presenting cells, APCs)提供抗原肽MHC复合物与T细胞受体特异性结合外,还必须有APCs提供协同刺激分子如免疫球蛋白家族成员(CD80、ICOSL等)、TNF家族成员(CD40、OX40、4-1BB、CD27、LIGHT等)和多种细胞因子的参与。随着研究的深入,不断有新的分子被发现参与、调控了T细胞的活化过程。因此,T细胞的活化与调节仍然是基础免疫学研究的重点,也是移植免疫学关注的热点。 T细胞免疫球蛋白粘蛋白(T cell immunoglobulin mucin,Tim)是2001年发现的表达在T细胞和DCs表面与细胞活化相关的新分子。小鼠TIM基因家族位于11B1.1,目前共发现8个基因,编码蛋白Tim-l~4和4个假想蛋白Tim-5~8。人类TIM基因家族只有3个成员,定位于染色体5q33.2,分别编码蛋白Tim-l, 3, 4(没有Tim-2)。Tim是一类具有共同基序的跨膜糖蛋白,其结构包括免疫球蛋白(Ig)样区、粘蛋白样区、跨膜区和胞内区。除Tim-4外,Tim-1,2,3的胞内区均含有酪氨酸激酶磷酸化位点,直接参与信号转导。 早期研究发现,Tim-1表达于所有活化的CD4~+ T细胞,并在其分化后仍高表达于Th2细胞,而低表达于Th1,Th17,CD11c~+骨髓源性树突状细胞(Dendritic cells,DCs)和CD19~+ B细胞。Tim-1的配体为Tim-4,与其它Tim蛋白不同,小鼠Tim-4只表达于APCs。它作为Tim-1的配体参与T细胞的活化和增殖,并能减少其凋亡。Tim-主要表达于Th1细胞和DCs,它与DCs上的Galectin-9结合后能导致Th1细胞的凋亡。 然而,随着研究的深入,人们发现Tim-1和Tim-4在免疫调节中的作用比预想的更为复杂。最近的研究显示,小鼠Tim-4与人IgG_1 Fc段融合蛋白(Tim-4-Ig)在不同的终浓度下能刺激或抑制培养体系中T细胞的活化。另外, Tim-4-Ig可以通过与小鼠初始CD4~+ T细胞上的某种配体结合抑制其活化,经证实,这种配体并非Tim-1。然而,Tim-4-Ig的这种作用只局限于不表达Tim-1的小鼠初始T细胞,它不能抑制预先激活的T细胞增殖。上述研究提示Tim-4-Ig可以与T细胞上的不同配体结合,介导不同的免疫效应。此外,Tim-1的不同单克隆抗体(3B3和RMT1-10)也可以对T细胞活化产生相反的作用,这可能取决于它们与Tim-1结合的亲和力不同或对细胞骨架结构的影响不同。因此,进一步阐明Tim-1调节T细胞反应的机制,对于开发治疗自身免疫性疾病和移植物排斥反应的新药物,具有重要的意义。 基于上述研究,本课题拟进一步:(1)合成人源化Tim-1胞外段和IgG_1 Fc段融合蛋白(Tim-1-Fc),检测其与小鼠不同种类细胞的结合情况,验证其是否具有交叉活性,并判定这种可能的结合是否是Tim-4依赖性的;(2)体外研究Tim-1-Fc对anti-CD3, anti-CD28 mAbs介导的小鼠CD4~+ T细胞活化,增殖,凋亡,细胞周期和对同种DCs介导的混合淋巴细胞反应(Allogeneic mixed lymphocyte response, allo-MLR)的影响,探讨其胞内信号转导途径;观察其对调节性T细胞(Regulatory T cells, Tregs)增殖和叉头状转录因子p3(Forkhead transcription factor p3, Foxp3)表达的影响;(3)通过腹腔注射Tim-1-Fc(对照组注射PBS和人IgG_1),阻断Tim-4-Tim-1介导的T细胞活化,观察其对小鼠颈部异位心脏移植物生存期的影响,初步揭示其抑制移植排斥反应的作用和体内机制;通过本课题研究,有望进一步认识Tim-1-Fc分子在T细胞介导的免疫反应和抑制同种移植物排斥反应中的作用,为寻找临床免疫抑制治疗的新靶点提供实验依据。 目的:合成人源化Tim-1胞外段和IgG_1 Fc段融合蛋白(Tim-1-Fc),检测其与小鼠不同细胞结合情况,验证其是否具有交叉活性,并判定这种可能的结合是否是Tim-4依赖性的。方法:从基因库中搜索人Tim-1胞外段和IgG_1 Fc段的cDNA序列,克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1上,利用转染试剂将重组质粒转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary, CHO)中,通过Western-blot检测Tim-1-Fc表达情况,经亲和、离子交换等多种层析方法纯化蛋白。采用流式细胞仪(Flow cytometry, FCM)检测Tim-1-Fc与未接受刺激的或刺激3天后的小鼠DCs,CD4~+CD25~- T细胞,CD4~+CD25~+ T细胞(Natural regulatory T cells, nTregs)结合情况,加入Tim-4单抗,阻断可能的Tim-4-Tim-1-Fc结合。结果:经Western-blot检测,合成的Tim-1-Fc分子量约62KD,纯度92%。Tim-1-Fc不结合DCs,nTregs和未活化的CD4~+CD25~- T细胞,但能选择性结合活化后的CD4~+CD25~- T细胞(Effector T cells, Teffs),且该作用不被anti-Tim-4 mAb阻断。结论:Tim-1-Fc构建成功。小鼠Teffs上存在人Tim-1的新型配体。 目的:观察Tim-1-Fc在体外对CD4~+ T细胞活化,增殖,凋亡和细胞周期,胞内信号转导,allo-MLR以及nTregs增殖、Fxop3表达的影响。方法:在CD4~+ T细胞培养体系中加入不同终浓度的Tim-1-Fc(1,5,10μg/ml),按不同比例(1:40,1:20,1:10)将DC与CD4~+ T细胞混合培养,采用3H掺入法检测细胞增殖,CSFE检测细胞分裂,ELISA检测培养上清液中Th1/Th2细胞因子分泌情况,PI/Annexin V双染色法检测各组CD4~+ T细胞凋亡的比例,RT-PCR法检测Tim-1-Fc对nTregs内Foxp3基因转录的影响,Western-blot检测Tim-1-Fc对细胞周期蛋白Cdk2,Cdk4,p27~(kip)表达及anti-CD3(2μg/ml), anti-CD28(1μg/ml)mAbs刺激后不同时间点(5, 15, 30min)CD4~+ T细胞内信号分子AKT,ERK1/2磷酸化情况的影响。结果:Tim-1-Fc不但能抑制CD4~+ T细胞表面活化标志CD25,CD69表达、抑制细胞分裂增殖,该作用不依赖于Tim-4(RT-PCR和FCM检测也未发现小鼠T细胞表达Tim-4);还能显著下调Cdk2,Cdk4而增加p27~(kip)表达,使细胞停滞在G1期;抑制CD4~+ T细胞内AKT,ERK1/2磷酸化;抑制allo-MLR,诱导T细胞对同种抗原的低反应性,减少IL-2,IFN-γ而促进IL-10的分泌。但Tim-1-Fc对CD4~+ T细胞凋亡,nTregs增殖和Foxp3表达无明显影响。结论:Tim-1-Fc在体外能通过与T细胞表面新型受体结合抑制CD4~+ T细胞活化、增殖和Th1源性细胞因子表达,使细胞停滞在G_0/G_1期,并下调T细胞内信号分子AKT,ERK1/2磷酸化水平。还能抑制小鼠allo-MLR,诱导T细胞对同种抗原的低反应性;但它不影响CD4~+ T细胞凋亡,nTregs增殖和Foxp3表达。 目的:观察Tim-1-Fc对小鼠心脏移植物存活期的影响并探讨其抑制排斥反应的体内机制。方法:采用BALB/c→C57BL/6小鼠颈部异位心脏移植模型,将受体分为3组(每组n=10):组1,心脏移植+PBS治疗组;组2,心脏移植+ hIgG_1(10μg/g/天术后0~6天)治疗组;组3,心脏移植+Tim-1-Fc(10μg/g/天术后0~6天)腹腔注射治疗组。专人记录心脏移植物存活时间。于术后第7天处死小鼠,收集血液、心脏、脾脏标本。Real-time PCR检测心脏移植物内淋巴细胞表面分子CD3, CD11b和炎性细胞因子IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10和转录因子Foxp3表达情况,病理检查心脏移植物内炎性细胞浸润和组织破坏情况。磁珠分选受体小鼠脾脏CD4~+ T细胞,用BALB/c小鼠DCs刺激,~3H掺入法检测其增殖情况,ELISA检测Th1,Th2细胞因子水平。FCM检测受体小鼠脾脏中CD4~+Foxp3~+调节性T细胞占总CD4~+T细胞比例,以及CD4~+CD25~- T细胞培养体系中加入Tim-1-Fc后Foxp3的表达变化。结果:三组小鼠心脏移植物存活时间分别为6.5±0.5,6.7±0.4和17.1±1.1天。Tim-1-Fc治疗组移植物内IL-2、IFN-γ、CD11b、CD3 mRNA表达水平显著较低,病理损害亦明显减轻,但IL-10水平升高(P0.05);Tim-1-Fc组受体脾脏来源CD4~+ T细胞接受同种异基因DCs刺激后增殖水平显著较低(P0.05);受体小鼠脾脏中CD4~+Foxp3~+调节性T细胞占总CD4~+T细胞比例显著升高(P0.05),但Tim-1-Fc并不能直接诱导CD4~+CD25~- T细胞表达Foxp3。结论:Tim-1-Fc能减轻小鼠心脏移植物Th1细胞因子表达和炎性细胞浸润,促进Th2细胞因子表达,降低受体脾脏内供体反应性T细胞对同种抗原的反应能力,显著延长移植物存活期;Tim-1-Fc虽不能直接诱导Tregs,但它通过调节Th1/Th2平衡向Th2发展,提高脾脏内CD4~+Foxp3~+ T细胞比例,调节Teffs/Tregs平衡向Tregs偏移,成功抑制了小鼠心脏移植物排斥反应,使其有望成为抗排斥治疗的新药物。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R392

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