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《第二军医大学》 2011年
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靶向重组腺病毒介导Hsp70基因表达治疗胰腺癌的实验研究

孙运良  
【摘要】:胰腺癌是恶性程度极高的常见消化系肿瘤,尽管近年来在影像学诊断、化疗、围手术期治疗和系统治疗方面取得了一定进展,但胰腺癌尚缺乏有效的治疗手段。因此,寻求有效的针对胰腺癌的治疗手段是目前胰腺癌研究的重要课题。近年来,随着肿瘤免疫学和分子生物学的研究进展,免疫基因治疗已成为胰腺癌综合治疗的有效手段之一。 许多研究结果均证实,Hsp70与免疫调节密切相关,肿瘤细胞来源的Hsp70可诱发针对该肿瘤的特异性免疫反应。Hsp70可与肿瘤细胞内的多肽抗原相结合,Hsp70-多肽复合物作为完整的抗原,与抗原递呈细胞表面的特异性受体结合进入抗原递呈细胞内,经加工后与MHC分子形成复合物而被转运至抗原递呈细胞表面,被T细胞识别,激发抗肿瘤的特异性免疫。Hsp70可以通过上调B7-1, B7-2等共刺激分子以及MHC II分子的表达而促进DC的成熟并能诱导DC和T细胞趋化至肿瘤细胞。此外,肿瘤细胞表面表达的Hsp70还可以激活NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。动物实验和体外均研究证实,肿瘤细胞来源的Hsp70可作为一种有效地抗肿瘤疫苗。 腺病毒载体由于宿主范围宽广、感染效率高、插入外源基因片段大,可介导外源基因短时呈高水平表达,且易于制备、病毒滴度高,已在成为基础研究和临床基因治疗中使用最多的载体之一。近年来,为了提高腺病毒介导基因治疗的效率,人们利用肿瘤细胞与正常细胞之间的某些生物学性状的差异,构建了肿瘤靶向性重组腺病毒。目前已有为数不少的肿瘤细胞特异启动子被鉴定并用于基因表达的靶向调控,如靶向乳腺癌的MUC1启动子、靶向肝癌的AFP启动子、靶向前列腺癌的PSA启动子以及靶向鼻咽癌的EB病毒启动子等。用上述启动子调控外源基因的表达可获得相对特异的肿瘤靶向作用,在提高肿瘤基因治疗疗效的同时,可控制基因治疗基因表达的安全性、降低其对正常细胞的毒副作用,实行抗肿瘤基因的定向表达。研究显示,CEA在正常胰腺组织中不表达,而在胰腺癌组织中则有高频率的阳性表达率,提示CEA基因表达与胰腺癌密切有关,是胰腺癌基因治疗比较广谱的分子靶标。 基于以上研究,本课题通过克隆Hsp70基因以及CEA启动子,采用CEA基因启动子控制Hsp70基因的表达,构建靶向重组的腺病毒。通过体内实验检测该重组腺病毒对胰腺癌细胞增值和凋亡的影响,体外实验观察该重组腺病毒对胰腺癌动物模型肿瘤生长的抑制作用,并分析其相关机制。 一、Hsp70基因和CEA启动子的克隆及CEA启动子活性检测 目的克隆Hsp70基因和CEA启动子,并对CEA启动子的活性进行检测。 方法热处理胰腺癌细胞株Panc-1,提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,通过PCR的方法扩增Hsp70基因。提取健康志愿者外周血基因组,经PCR的方法扩增CEA启动子。分别将Hsp70基因和CEA启动子亚克隆至T载体后,进行DNA测序。用酶切的方法将CEA启动子插入到质粒pGL-6的多克隆位点,构建质粒pGL6-pCEA。用电化学发光法检测胰腺癌细胞株培养液中CEA的含量。分别将pGL6-pCEA和pGL6质粒通过脂质体转入CEA阳性和阴性胰腺癌细胞中,通过双荧光素酶报告基因系统检测CEA启动子的活性。 结果Hsp70基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳后,约2000bp处可见有明显条带,与目的基因大小一致,经DNA测序,结果与GenBank中Hsp70的全长编码区序列一致。CEA启动子PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后显示在约380bp处有明显条带,与预期结果一致。DNA测序结果与文献报道的CEA启动子序列一致。CEA含量检测显示,胰腺癌细胞株SW1990、Capa-Ⅱ、Pac-1均呈阴性分泌,而BxPC-3、CF和DSL-6A/C1呈阳性分泌。经过双荧光素酶分析显示,CEA阴性胰腺癌细胞中pGL6-pCEA荧光素酶相对活性与对照pGL6相比,无统计学差异(P0.05)。CEA阳性的胰腺癌细胞株pGL6-pCEA荧光素酶的相对活性显著高于对照组pGL6,差异有统计学以及(P0.01)。 结论成功克隆出Hsp70基因和CEA启动子,所克隆的CEA启动子能够在CEA阳性的肿瘤细胞中较好的驱动下游基因的表达。 二、靶向重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70的构建及鉴定 目的构建CEA启动子驱动下靶向表达Hsp70基因的重组腺病毒。 方法通过酶切的方法将Hsp70基因插入到质粒PDC316的多克隆位点,并以CEA启动子替换质粒PDC316- Hsp70的启动子MCMV,构建穿梭质粒PDC316–pCEA -Hsp70。将所得的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHG lox△E1, 3Cre在HEK293细胞中进行同源重组获得重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70,以PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。通过CsCl梯度离心法纯化病毒, TCID50法测定病毒滴度。分别以重组的腺病毒感染CEA阴性的胰腺癌细胞株SW1990和CEA阳性的BxPC-3、DSL-6A/C1,通过PCR和ELISA检测Hsp70基因mRNA和蛋白表达情况。 结果酶切鉴定表明穿梭质粒PDC316–pCEA -Hsp70构建成功。PCR结果显示,重组腺病毒可扩增出和阳性对照大小一致的Hsp70片段,表明重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70构建成功。经TCID50法测定病毒滴度,得到重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70的滴度为2.5×1010 PFU /ml,对照病毒Ad5-control的滴度为2.2×1010 PFU /ml。感染重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70后,CEA阳性的BxPC-3、DSL-6A/C1的细胞株中Hsp70mRNA表达较Ad5-control和PBS明显增加;而CEA阴性的SW1990细胞株Hsp70mRNA则无明显变化。BxPC-3和DSL-6A/C1细胞株中的Hsp70含量Ad5-pCEA-Hsp70组分别为398.0±76.9ng/ml和210.7±39.1ng/ml,与Ad5-control以及PBS相比,差异具有显著性(P0.01),而SW1990细胞株中Hsp70蛋白的含量则无明显变化(P0.05)。 结论成功构建了能够在CEA阳性的细胞中靶向表达Hsp70基因的重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70,为进一步研究奠定了基础。 三、重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70治疗胰腺癌的实验研究 目的观察重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70对体外培养的胰腺癌细胞增值和凋亡的影响以及对大鼠胰腺癌动物模型肿瘤生长的影响,并分析其相关机制。 方法以重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70感染胰腺癌细胞株,通过MTT法检测细胞增值活力的变化,流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响。建立大鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,随机分为三组,分别给予Ad5-pCEA-Hsp70、Ad5-control以及PBS进行治疗。对比不同时间点三组肿瘤大小,评价抑瘤效果。取血检验生化指标,并用ELISA的方法检测外周血Hsp70蛋白含量及细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的含量。取动物的移植瘤常规HE染色,观察淋巴细胞浸润情况;免疫组化染色检测CD4+T和CD8+T染色积分;TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况。分离动物脾脏单核细胞,通过流式细胞仪检测CD83+细胞比例,并观察脾淋巴细胞对体外培养的大鼠胰腺癌细胞的杀伤能力。 结果当MOI为0.1和1时,重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70对胰腺癌细胞的增值活力并无明显的影响(P0.5)。当MOI=10和100时,与Ad5-control以及PBS相比,Ad5-pCEA-Hsp70对胰腺癌细胞株BxPC-3和DSL-6A/C1的细胞增值活力具有显著的抑制作用(P0.5,P0.01)。以MOI=10的重组腺病毒感染不同的胰腺癌细胞株,结果显示,与Ad5-control以及PBS相比, Ad5-pCEA-Hsp70对肿瘤细胞的凋亡并无明显影响(P0.5)。动物实验结果显示,治疗后第4、6、8周,Ad5-pCEA-Hsp70组肿瘤体积为分别为724.4±81.6mm3、681.3±64.9 mm3、648.0±65.9mm3,分别与Ad5-control组及PBS组相比,差异具有统计学意义(P0.01)。通过检测血清中ALT、AST、BUN以及Cr,结果显示,各组动物之间各指标均无统计学差异(P0.05)。ELISA结果显示,Ad5-pCEA-Hsp70组动物外周血Hsp70蛋白及细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的含量均显著高于Ad5-control组和PBS组(P0.01,)。HE染色发现,与Ad5-control组和PBS组相比,Ad5-pCEA-Hsp70组有较多的淋巴细胞浸润。TUNEL法检测凋亡发现,Ad5-pCEA-Hsp70组的凋亡指数为12.6±3.2%,与Ad5-control组(4.4±0.8%)及PBS组3.6±0.8%)相比,差异具有统计学意义(P0.01)。免疫组化结果显示,Ad5-pCEA-Hsp70组CD4与CD8染色积分别显著高于Ad5-control组及PBS组(P0.01)。经流式细胞仪检测,Ad5-pCEA-Hsp70组CD83+细胞比例为10.8±1.3%,显著高于Ad5-control组及PBS组(P0.01)。脾淋巴细胞介导的CTL实验中,当效靶细胞比为1:1时,三组动物之间并无统计学差异(P0.5),但随着效靶细胞比的增加,Ad5-pCEA-Hsp70组对胰腺癌细胞的杀伤能力较Ad5-control组和PBS组明显增加(P0.05,P0.01)。 结论重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70介导的Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌动物模型的肿瘤生长具有明确的抑制作用,其机制与促进DC的成熟、诱导细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的分泌、促进CD4+T和CD8+T淋巴细胞浸润有关。 小结:本课题通过克隆Hsp70基因和CEA启动子,构建CEA启动子驱动下表达Hsp70基因的靶向重组腺病毒。动物实验表明,重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70介导的Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌动物模型的肿瘤生长具有明确的抑制作用,其机制与诱导机体的抗肿瘤免疫反应有关,且对机体无明显毒副反应。我们的研究为进一步利用该重组腺病毒靶向性的治疗胰腺癌患者提供了理论依据和实验基础。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.9

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【引证文献】
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